登上 CRISPR 浪潮

撰文｜馬千惠

對分子生物學家而言，CRISPR 是一非常強大的工具，可以用來更瞭解基因體如何運作，以及探討更深入的問題。2016年「自然」期刊（Nature ）整理出 CRISPR-Cas9 發展的五個方向，及其如何改變科學家們研究的方法。

（一）壞掉的剪刀（BROKEN SCISSORS)

CRISPR-Cas9 系統主要由兩個部分組成，一個可以辨識特定基因序列的引導RNA 分子，和一個具有分子剪刀特性的 Cas9 酵素，引導RNA 分子讓 Cas9 酵素與特定基因序列結合，進而剪斷DNA。此特性提供想要藉由破壞特定基因來研究其功能的科學家一個威力強大的工具。同時配合提供特定的修復模版，使基因以不同方式修復，可以讓研究者在任何基因體特定位置放入任何一段新序列。

2012年，當大家正致力於利用此工具剪斷人類基因時，加州大學舊金山分校系統生物學家Jonathan Weissman 所帶領的團隊卻有不一樣的做法: 破壞分子剪刀。Stanley Qi 將 Cas9 酵素加以突變（mutate）（註1），使其雖然可以結合至引導 RNA 所辨識的基因序列，卻失去將其切斷的功能，同時誘變的 Cas9  酵素阻擋了其他轉錄所需的蛋白質與此特定基因結合，形同在不影響與改變DNA 序列的狀況下關掉此特定基因的基因表現。科學家不滿足止步於此，他們更進一步再將可以活化基因表現的蛋白質接到這被破壞的剪刀 （誘變Cas9 酵素）上，讓特定基因表現得以被活化，建立了一套在不影響原DNA 序列狀況下，可以自由打開或關閉基因表現的系統。數個實驗室團隊也陸續發表了更多成果，甚至可在同一實驗中調控三個或更多的基因，應用於複雜生物機制的研究。

(二）CRISPR 非遺傳性的調控 (CRISPR EPIGENETICS)

從事基因療法研究的荷蘭遺傳學家 Marianne Rot，一開始致力於尋找造成疾病的突變基因，但是後來發現更多疾病是來自基因表現受到干擾，而非源於單一的基因突變。她認為最好控制基因活性的方法，就是調控基因表現。組蛋白（histones) 是纏繞包裹DNA 的蛋白質，組蛋白包裹 DNA 的程度會影響到其他到蛋白質靠近DNA的情形，且組蛋白與DNA的結合程度會隨著個體發育和環境而改變。科學家發現：從大腦活動到腫瘤生長，都和基因序列以外的調控有關，但是研究的瓶頸在於無法改變特定基因位置的標記。CRISPR-Cas9 技術的出現，讓這個研究瓶頸看到解套的曙光。2015年Charles Gersbach 成功地將一個可以將乙醯基接到組蛋白上的酵素接在失去剪斷 DNA 功能的 Cas9 酵素上，再藉由引導 RNA 將此酵素帶至目標基因，進而影響該基因的表現。

（三）CRISPR 破解密碼 (CRISPR CODE CRACKING)

超過98%的人類DNA和蛋白質的合成無關，科學家們認為這大多數的DNA 應該也有重要功能，只是我們還不知道。CRISPR-Cas9 技術提供了一個方法來探討此一問題。利用此技術，科學家們可以針對特定序列，例如做為増強子（enhancer) 或轉錄出非轉譯型 RNA 的 DNA 序列去做研究。Farnham 和她的團隊發現，原本以為和前列腺癌和大腸癌有關的突變加強子，經由CRISPR-Cas9 刪除後，並不影響旁邊基因的表現，顯示我們原本用來分析加強子強度的方法，並不能反映出真實狀況。由遺傳學家David Gifford 和Richard Sherwood 領導的研究團隊在四萬鹼基對長的 DNA 序列做一系列的突變，嘗試定出影響基因表現的 DNA 序列圖譜。不過 CRISPR-Cas9 技術也不是萬能的，在此方面的應用有其侷限性，畢竟 Cas9 酵素只能由引導 RNA 帶至特定區域，且在靠切割位置處 DNA序列必須有一定鹼基對序列共通性，當進行非轉譯型 DNA的研究時，不能在DNA任何位置任意切割，因為可能會產生各種非預期的影響。最近張鋒所帶領的團隊找到另一群 Cpf1 酵素群，其作用和 Cas9  酵素類似，但是可辨識不一樣的DNA序列，或許未來可以發現各種不同酵素，用來切割所有想要研究的基因體位置。

（四）CRISPR 以光來控制基因表現 (CRISPR SEES THE LIGHT)

Gersbach的實驗室使用基因編輯技術來探討細胞命運以及其調控，他們希望能在培養皿裏培養組織，用來篩檢藥物，並測試細胞治療成效。但是 CRISPR-Cas9 的作用結果是永久性的，與他們需要能夠暫時打開或關掉基因表現的期待不合。於是他們加了一個能被藍光活化的蛋白質到失去切割能力的 Cas9 酵素上：當他們用藍光照射細胞，特定基因開始表現，關掉藍光特定基因則停止表現。其他團隊也有發展出類似的技術，改以化學物質當作基因表現的開關。

（五）以CRISPR來製造各種生物模型（MODEL CRISPR)

以原有的技術要製造出基因轉殖動物來作為研究模型是非常耗時耗費的工程，CRISPR-Cas9 將這以年為單位的過程大幅縮短為一個月內可完成的實驗。所以許多之前無法做到的研究，如今都有可能達成，例如從癌症到神經退化研究，都已採用此一新技術。

一般而言，研究單位會將他們新發展出來的分子工具（Techniques of molecular biology）（註2）或新質體（Plasmid）寄存於非營利事業的Addgene 公司，以提供其他有興趣的科學家使用。自從2013年初研究人員首度發表他們能以 CRISPR-Cas9 技術切割人類細胞內基因體任何一特定位置後，Addgene 公司的詢問電話就沒停過，分子生物學家們都急於獲得此技術，能夠簡單且準確地修改編輯幾乎所有生物體的基因體。

目前真正革命性的發展正在實驗室裏展開，CRISPR 提供生物學家所需要的一大特點：特定明確性，可以準確地辨識龐大的基因體裹特 定的序列。而編輯DNA 只是其中一項技能，科學家進一步將此技術做不同的改變，可以將蛋白質送至特定基因體位置作調控，以啟動或停止特定基因表現，甚至可以設計整個生物循環，最終了解細胞內的系統和疾病的細節。 畢竟CRISPR-Cas9 只是一項技術，我們現在擁有此一強大的工具，最終仍需回歸解決生物問題本身，那才是我們的真正目的。

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註1：更改 DNA 序列，重新做出突變的蛋白質。
註2：研究分子生物學所使用的工具或技術，例如分子純化繁殖（Molecular cloning）、聚合酶連鎖反應（Polymerase chain reaction (PCR)）、凝膠電泳Gel electrophoresis、南方[氏]印漬術Southern blotting等等。

參考文獻:
1. Nature 531, 156–159 (10 March 2016) doi:10.1038/531156a
2. Qi, L.S., Larson, M.H., Gilbert, L.A., Doudna, J.A., Weissman, J.S., Arkin, A.P., and Lim, W.A. (2013). Repurposing CRISPR as an RNA-guided
3. Dow, L.E., Fisher, J., O'Rourke, K.P., Muley, A., Kastenhuber, E.R., Livshits, G., Tschaharganeh, D.F., Socci, N.D., and Lowe, S.W. (2015). Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature biotechnology 33, 390-394.
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