基因編輯技術 CRISPR 可以對抗 COVID-19？

COVID-19的大流行凸顯在無有效疫苗及治療藥物的情況下，發展新興抗病毒方法的重要性。已有研究顯示基於CRISPR/Cas13策略的人體細胞的預防性抗病毒CRISPR（PAC-MAN）可以在細胞培養中有效抑制SARS-CoV-2，藉由設計和篩選標靶作用於病毒基因體保守區域的CRISPR RNA（crRNA），可以有效標靶作用並切割 SARS-CoV-2的RNA序列，顯著抑制病毒生長，生物資訊的分析結果則顯示有6個crRNA可標靶作用超過90％的冠狀病毒。若能解決傳遞工具選擇及安全性顧慮的問題，PAC-MAN有可能成為對抗COVID-19的有效策略之一。

撰文／陳淵銓

●CRISPR用於對抗病毒

叢集的規則間隔的短迴文重複序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）/ CRISPR相關蛋白（CRISPR associated protein, Cas）（CRISPR/Cas）系統是一種被廣泛應用的基因編輯技術，並已成功在活體外（in vitro）及動物實驗中作為抗病毒策略用於清除多種病毒，如B型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）、鼻咽病毒（Epstein-Barr, EBV）、愛滋病毒（human immunodeficiency virus, HIV)、巨細胞病毒（cytomegalovirus, CMV）、簡單皰疹病毒第一型（herpes simplex virus-1, HSV-1）及人類乳突病毒（human papillomavirus, HPV)等。因此，CRISPR亦有潛力開發作為治療COVID-19的新型抗病毒策略。

●開發CRISPR作為對抗 COVID-19的策略

在 2020年，美國研究人員設計並篩選了CRISPR RNA（crRNA）標靶作用於病毒基因體的保守區域，並鑑定了人在類肺部上皮細胞（A549 細胞株）培養中標靶作用到新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）和A型流行性感冒病毒（Influenza A virus subtype, H1N1 IAV）的功能性crRNA。人類細胞的預防性抗病毒CRISPR（prophylactic antiviral CRISPR in human cells, PAC-MAN）是一種根據CRISPR / Cas13的抗病毒策略，他們的實驗結果發現Cas13d PAC-MAC可有效地標靶作用和切割 SARS-CoV-2的RNA序列，而且可以減少呼吸道感染的H1N1 IAV的病毒負載量（viral load），顯著抑制病毒的生長。另外，生物資訊學的分析顯示有6種crRNA可以標靶作用到90％以上的冠狀病毒，而且PAC-MAN減少了約90％的病毒負載量，並可標靶作用多種病毒，但目前此研究僅在細胞培養中進行，需要進行活體內實驗和進一步的臨床試驗方能驗證CRISPR的效用。

●發展前景及技術限制

基因標靶技術（如CRISPR）的發展迅速，作用專一性及侷限性的問題已大幅改善，CRISPR因具有可因應病毒高變異性而自行設計合成核酸序列的特點，使得PAC-MAN確實具有潛力成為阻斷病毒複製和基因表現的方法。使用CRISPR/Cas13d對抗冠狀病毒以保護人體細胞免受感染或清除受到感染之細胞內的病毒，將可能提供一種取代傳統抗病毒藥物的替代性或補充的治療策略（alternative or additional therapeutic strategy）。

然而，在臨床應用中使用PAC-MAN還存在一些技術限制如下：（1）PAC-MAN以細胞自主方式發揮作用，顯示僅有可以表達Cas13d和crRNA的細胞可以直接對抗標的病毒。（2）為確保PAC-MAN對患者有效，需要在一定比例的細胞中充分表現PAC-MAN，其範圍需經由更多進一步的實驗加以確認。（3）由於crRNA的表現在SARS-CoV-2序列的切割效率上扮演了關鍵的角色，故調節細胞中Cas13d水平及其同源crRNA的能力，對於有效抑制病毒十分重要。（4）由於SARS-CoV-2 的RNA基因組呈現二級結構（secondary structure）或被保護性蛋白覆蓋，故病毒可能不易被抑制，所以須對crRNA進行普遍篩選才有助於鑑定出標靶作用到活SARS-CoV-2的高效率crRNA。

●臨床應用面臨的挑戰

在先前的研究中，已有許多CRISPR成功用於抑制病毒裂解性複製（lytic replication）和/或清除潛伏性感染（latent infection）的報告。但這些都只是在活體外和/或活體內（in vivo）研究，真正進入人體臨床試驗者仍付之厥如，CRISPR要應用在臨床病人身上仍有關鍵性挑戰如下：

1.傳遞工具（delivery tool）的選擇：傳遞工具是一種用以促進核酸（nucleic acid）進入標的細胞的因子，主要的功用是增加DNA（如基因、DNA片段及質體 DNA）或RNA（如mRNA、 miRNA及siRNA）的轉染（transfection）效率。目前已有多種傳遞工具開發成功用於基礎研究，包括脂質（lipoid）、病毒（如 lentivirus, adenovirus, adeno- associated virus, etc.）、奈米粒子（nanoparticle）、細菌（Salmonella）、基因槍（gene gun）、電衝擊（electroporation）及奈米吸管（nanostraw）等。CRISPR要臨床應用於人體治療，需有適當的傳遞工具以運送 CRISPR到達標的細胞或病毒入侵之位置，但要選擇一種兼具專一、安全及高效率的傳遞工具十分困難，

2.安全性顧慮: CRISPR作用於標的基因時會因產生脫靶效應（off target effect），而造成不可預測的變異，雖然現在的技術已可大幅降低其發生的比率，但完全避免仍是不可能的。脫靶效應在細胞及動物實驗時，只要妥善處理此種變異細胞或動物即可，但應用在人體治療時，必須考量不會傷害到正常的細胞及健康的組織，萬一引起突變甚至致癌，造成的傷害和後果將難以補救。因此，增強CRISPR作用的專一性極為重要，如何僅殺死入侵的病毒而不傷害人體是關鍵性的課題。

在進行臨床試驗之前，必須選擇適當的傳遞工具以確保傳送CRISPR時的專一性、安全性及高效率，並排除脫靶效應可能引起的突變或腫瘤發生的風險。如果這些障礙可以克服，那麼相對於傳統的抗病毒藥物而言，使用PAC-MAN策略應用於COVID-19的人體治療就能顯現獨特的優點及治療利益。

參考資料：

1. Abbott TR, Dhamdhere G, Liu Y, Lin X, Goudy L, Zeng L, Chemparathy A, Chmura S, Heaton NS, Debs R, Pande T, Endy D, Russa MFL, Lewis DB, QI LS. Development of CRISPR as an antiviral strategy to combat SARS-CoV-2 and influenza. Cell 2020, 81(4):865-876.e12. doi: 10.1016/j.cell.2020.04.020. Epub 2020 Apr 29.
2. Luther DC, Lee YW, Nagaraj H, Scaletti F, Rotello VM. Delivery approaches for CRISPR/Cas9 therapeutics in vivo: advances and challenges. Expert Opin Drug Deliv. 2018, 15(9):905-913. doi: 10.1080/17425247.2018.1517746. Epub 2018 Sep 12.
3. Lino CA, Harper, JC, Carney JP, Timlin JA. Delivering CRISPR: a review of the challenges and approaches. Drug Deliv. 2018, 25(1):1234-1257. doi: 10.1080/10717544.2018.1474964.
4. Rodríguez-Rodríguez DR, Ramírez-Solís R, Garza-Elizondo MA, Garza-Rodríguez ML, Barrera-Saldaña HA. Genome editing: A perspective on the application of CRISPR/Cas9 to study human diseases (Review). Int J Mol Med. 2019 Apr;43(4):1559-1574.doi: 10.3892/ijmm.2019.4112.