CRISPR發展之英雄榜

德州大學分子生物科學研究所馬千惠編譯/臺大科教中心陳藹然責任編輯

編譯來源:Lander, E.S. (2016). The Heroes of CRISPR. Cell 164, 18-28.

2013年一篇指出 CRISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats) 技術可以準確且有效率地編輯活體真核細胞基因體的研究報告,在科學界颳起一陣風暴,從生物醫學到農業,有成千個實驗室應用此技術。本文將探討從二十年前起發現微生物的基因體含有奇怪的重複序列,經確認為此一適應性免疫系統,到了解其生物特性,進而運用在基因工程上的發展過程,以及這科學研究歷程給我們的啟示。

CRISPR 規則性間隔重複迴文序列群的發現,起源於西班牙一地中海海港,Francisco Mojica 的指導教授發現生活在沼澤中一耐鹽性極高的古細菌,其基因體會因為生長環境鹽度不一樣,而被限制酶切出不同片段。Mojica分析這些不同的基因片段,發現一個特殊結構含有類似迴文的重複序列及間隔,和其他已知的微生物重複序列不同。之後十年的時間,他致力於解開這結構的神密之處,發現其他的古細菌也具有相似的重複序列,而一日本研究團隊在細菌裏也發現類似的結構。Mojica認為如此相去甚遠的微生物卻有相似的結構,在原㧡生物中一定有其特殊意義。由於Mojica才剛開始教職工作,研究經費不足,只好轉而以生物資訊學來分析這奇特的重複序列,並命名為 SESRs (short regularly spaced repeats),之後修改成 CRISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats)。

20世紀結束時,Mojica已在二十種微生物基因體內找到 CRISPR序列。其他研究團隊在不同微生物也有相同的發現,並且找到CRISPR 相關基因(CRISPR associated genes, cas),但是其生物功能仍是未知,於是眾多假說被提出。後來Mojica 在分析重複序列之間的間隔序列(spacer) 有了重大發現: 一特定種大腸桿菌的 CRISPR 的間隔序列,居然和感染許多不同種大腸桿菌的P1 噬菌體的基因序列吻合,可是此一特定種的大腸桿菌本身並不會被P1 噬菌體感染,也就是説擁有此間隔序列,可以保護細菌本身不會再被同一噬菌體感染。他又繼續分析了4,500 段間隔序列,其中88段和已知序列吻合,其中三分之二是來自病毒或接合質體。可是當他要發表此重大的發現時卻連續被各大期刊拒絕,經過十八個月的努力,終於在2005年發表於 Journal of Molecular Evolution。

同時CRISPR系統的研究在世界各地陸續有不同的進展。法國國防部的科學家 Gilles Vergnaud 分析造成越南1964-1966年鼠疫的61株樣品,發現其重複序列都相同,只有其同事Christine Pourcel發現在CRISPR 的前端間隔序列 (spacers)有所不同,因此提出CRISPR可能是將過去受感染的記憶保存下來,保護細菌不再受感染,但是他們的論文同樣面對被期刊拒絕的狀況,最後晚 Mojica一個月的時間發表於 Microbiology。服務於法國一食品公司的研究者Philippe Horvath和其同事Rodolphe Barrangou在2007年以實驗證明 CRISPR 是一適應性防禦免疫機制,同時他們也發現 Cas7參與形成新的間隔和重複序列,以及 Cas9 具有兩種核苷酸酶部位HNH和 RuvC可以切斷核苷酸,且為達到完全的免疫功效,間隔序列和標的序列必須完全相同。

2008年德國科學家John van der Oost 和其同事首先直接設計出以CRISPR為基礎的免疫機制,像是幫細菌打了疫苗,不再受噬菌體感染。美國科學家 Luciano Marraffini和Erik Sontheimer 則證實 CRISPR 是以 DNA 為標的,並首先提出CRISPR 可能可以應用於不同物種的基因編輯,雖然有提出專利申請,但由於缺乏實驗佐證,後來終究放棄。

Sylvain Monieau 延續 Barrangou 先前對 Cas9的研究,發現 Cas9會準確地切在PAM(proto-spacer adjacent motif) 前三鹼基對的位置。另外 Emmanuelle Charpentier 和 Jὂrg Vogel團隊則發現在細胞內第三多的轉錄物 tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)會和由CRISPR序列所轉錄出來的crRNA前身結合,再由 RNaseIII修剪為具功能性的產物,研究至此階段已經能掌握CRISPR系統所需的要件。接下來是 Virginijus Siksnys成功地將 CRISPR 系統移至不同的生物體,達到一重要里程碑,確認 CRISPR-Cas9 系統所需且足夠的元件:Cas9 核苷酸䩈、crRNA以及tracrRNA。他們以純化的 Cas9蛋白研究整個過程的細節,最戲劇化的發現是利用設計CRISPR裏不同的間隔序列(spacer),讓此系統去辨識特定的基因位置並切斷 DNA,Siksnys 在2012年以此申請美國專利。大約在同時 Charpentier 和 Jennifer Doudna 合作也有同樣的發現和進展,他們更進一步將crRNA和tracrRNA 連結成sgRNA (single-guide RNA),此一概念後來被廣泛使用,經修改可以更有效地在生物體內作用。兩個團隊也同時都提出此一系統未來在生物科技上的應用潛力。

圖一 發展基因體編輯技術的基礎中三種已知系統中最簡單的系統,Class2, Type II CRISPR-Cas系統。 A. 系統包含了CRISPR序列、四個蛋白基因(cas9,cas1,cas2和cns2)以及tracRNA。其中 CRISPR序列包括重複區域(黑色鑽形)與外來入侵的基因片段所形成的間隔序列(spacer,彩色矩形)。一旦入侵的DNA和間隔序列吻合,cas9所轉譯出核苷酸酶,會將其切斷,達到免疫的功效。而另外三個蛋白則是從入侵的DNA片段做出新的間隔序列,使自身不會再受相同的感染。 B. Pre-crRNA和 tracrRNA被轉錄出來 C. Pre-crRNA和 tracrRNA以其互補序列結合在一起,再由Cas9蛋白及 RNaseIII將其修短。 D. 所形成結構(Cas9+tracrRNA+crRNA)開始尋找和間隔序列相吻合的序列,找到後Cas9會抓住具有分子把手功能的 PAM,然後結合至目標區。 E. 於PAM上游三鹼基對處切斷目標DNA

下一個重大的發展來自華裔科學家張鋒 (Feng  Zhang),他進一步修改 Cas9,找到適合存在人類細胞內的 tracrRNA,成功地將CRISPR系統應用到哺乳動物細胞,可以高效率且準確地修改特定基因,張鋒更進一步以此系統做出複雜的老鼠系統來研究遺傳疾病及癌症,並且從全基因庫篩檢,研究特定生物過程的必需基因,同時他和生物資訊學者Kooin 發現新的 Class 2 CRISPR系統,只需另一核苷酸酶及 crRNA兩個元素便足夠。張鋒在2013年初於 Science 發表論文,成為此一領域被引用最多的文章。另一科學家 George Church也和張鋒有相同的發現,即以全長的crRNA-tracRNA連結在一起,在哺乳動物細胞內的功能比較好,他同時編輯七處基因,分析不同的基因重組機制,並在同一期期刊發表編輯人類基因體的論文。至此眾多科學家們陸續成功地以CRISPR為基礎去編輯許多不同生物的基因體,更朝人類基因療法及農業生產發展,甚至提出以此技術去設計人類胎兒的可行性。

圖二 二十年來CRISPR系統的發展橫跨九個國家十二個城市 1. 1993年 發現 CRISPR 2. 2003年 CRISPR 是一適應性免疫系統 3. 2006年 實驗證實CRISPR確實具適應性免疫功能 4. 2008年 程式設計CRISPR 5. 2008年 CRISPR 作用在DNA 6. 2010年 Cas9 蛋白在crRNA的引導下切斷雙股 DNA 7. 2010年 發現tracrRNA 8. 2011年 在相隔甚遠的生物體內重建 CRISPR系統 9. 2012年 在生物體外研究 CRISPR 10. 2012年 在哺乳類動物細胞内進行基因體編輯

二十年來整個CRISPR系統的發展過程,訴説著許多不同的層面的故事,包含了科學的研究發現、發表論文所面對的困難、研究經費問題和此技術可能引發的科學倫理問題,以及社會大眾的認知。最初開研究動機只是想要了解耐鹽性微生物所含的奇怪重複序列、軍事上要抵抗生化武器或是食品工業上要增加優格的生產,並不是以編輯人類基因體或治療疾病為目的。而目前新興的科學研究方法,是在沒有假設前提下,去分析大數據及基因庫的資料。更特別的是,在CRISPR系統發展史上幾個關鍵發現的科學家都非常年輕,他們不懼風險願意挑戰,擁有強烈的研究動機與信心,卻常受限於沒有足夠的研究經費,這點暴露出科學研究經費資源分配問題,值得國家重新考量嚴肅面對。

 

參考文獻

  1. Lander, E.S. (2016). The Heroes of CRISPR. Cell 164, 18-28.
  2. Mojica, F.J., Juez, G., and Rodriguez-Valera, F. (1993). Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites. Molecular microbiology 9, 613-621.
  3. Mojica, F.J.M., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., and Soria, E. (2005). Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol 60, 174-182.
  4. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., et al. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823.
  5. Mali, P., Yang, L., Esvelt, K.M., Aach, J., Guell, M., DiCarlo, J.E., Norville, J.E., and Church, G.M. (2013). RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826.
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