CRISPR 會不會是可以修正遺傳疾病基因變異的立可白呢？
■八月初，Nature 刊登了一篇長篇論文，標題簡單明確，一刊上網就毫不費力的吸引了眾人焦點。到底是什麼研究這麼厲害？美國科學家在人類胚胎細胞上成功利用 CRISPR 技術，將遺傳性肥厚型心肌症的基因變異「矯正」回正常序列。但研究結果一刊登，引起的譁然與質疑也始料未及。這個好結果到底是成功了，還是只是美麗的誤會一場呢？
撰文｜駱宛琳
美國 Oregon Health & Science University 研究中心的 Mitalipov 博士實驗室，在人類胚胎上，成功把導致遺傳疾病的基因變異序列，修正回正常序列了！Mitalipov 實驗室所使用的，就是響噹噹的 CRISPR 與 Cas9 新技術。
對於遺傳性疾病，如果可以在發生變異的基因序列上，直接將基因突變修復回正常序列，是最一勞永逸的方法。隨著CRISPR/Cas9 技術的成熟，這想法也不再遙遠如天邊浮雲；相較傳統基因編輯的方法，CRISPR/Cas9 便宜、快速又精準。在極短時間內，CRISPR/Cas9 風靡了整個科學界。CRISPR/Cas9 可以想像成是裝了 GPS、專門針對 DNA 的愛德華剪刀手。
Cas9 蛋白的真實身份是DNA 核酸內切酶，能夠在 DNA 雙鏈上大剪刀一咖嚓，讓 DNA 雙股斷裂。而能為 Cas9 剪刀手充當導航儀的 CRISPR，是一段寫了目標 DNA 在哪裡的序列。當 CRISPR 被轉錄為成熟的 CRISPR RNA（crRNA）之後，會跟 Cas9 裝在一起，然後看哪一段 DNA 跟 crRNA 的序列長得一樣，緊緊跟對應的 DNA 那股結合。當 crRNA 結合上 DNA 之後，會讓 DNA 雙股分離，Cas9 於是能夠將 DNA 剪斷。雙股斷裂的 DNA 在細胞內是火山爆發等級的緊急事件，細胞會啟動修復機制，嘗試把 DNA 復原回原來的樣貌。而這於是開了一道門，讓科學家有機會利用細胞修復 DNA 的時候，用點小伎倆讓 DNA 被修改為「想要的樣子」。例如：將遺傳疾病的突變序列，修復為正常序列。而這也是美國 Mitalipov 博士實驗室想要嘗試的事。
這次，Mitalipov 實驗室挑定了遺傳性肥厚型心肌症（hypertrophic cardiomyopathy）。肥厚型心肌症是造成運動員猝死的主要原因之一，臨床上症狀是心臟衰竭。但也因為病發時間較晚，所以致病基因容易傳到下一代。遺傳性肥厚型心肌症是顯性遺傳，大約每五百個成人裡，就可能有一人罹患遺傳性肥厚型心肌症。目前對於此病，多半是針對症狀治療。唯一能從病根下藥的方法，是利用體外人工受精技術，在胚胎植入前再用遺傳學基因診斷，把沒有遺傳到基因變異的正常胚胎篩選出來。Mitalipov 實驗室想要利用 CRISPR/Cas9 來提供另一個對症下藥的方法。藉由 CRISPR/Cas9 引起胚胎細胞內 DNA 雙股斷裂，讓細胞啟動能重組修復機制，然後一舉將變異基因修改掉。
在細胞株、老鼠、猴子身上，利用 CRISPR/Cas9 技術修改基因序列已是屢見不鮮，我們也學到了許多關於 CRISPR/Cas9 的黑暗面。已知的困擾主要是三大難處：其一，是 crRNA 找到目標 DNA 的精確度，也就是所謂的脫靶效應（off-target effect）。因為 crRNA 通常是長約 20 個鹼基對的序列，就像我們偶爾會在路上認錯人一樣，科學家也一直擔心 crRNA 會不會認錯目標 DNA。認錯人可以道歉就了事，但 crRNA 一但指鹿為馬，讓 Cas9 在無辜的 DNA 序列上大剪刀一揮，就真得是愈幫愈忙了。
其二，CRISPR/Cas9 再精準、效率再高，也不會是百分之百。而也因為這個難處，導致第三個麻煩。通常用 CRISPR/Cas9 技術所得到的基因轉殖老鼠，第一個子代都還沒有辦法直接拿來做實驗，要讓基因轉殖老鼠再跟沒被改造的正常老鼠交配繁殖一代。這是因為通常把 CRISPR/Cas9 送進老鼠胚胎細胞的時候，老鼠胚胎可能已經是發育成兩個細胞以上的多細胞狀態。因此，每個細胞被「改造」後的基因序列可能都不太一樣，讓最後的個體像是萬花筒一樣，會有不只一種的基因序列。
那 Mitalipov 怎麼解決這些問題呢？
參與實驗的是名成年男性，有肥厚型心肌症的家族遺傳病史，肇因是 MYBPC3 其中一股DNA上的序列，少了四個鹼基對（另一股序列正常），以至於蛋白質失去功能。MYBPC3基因負責表達心肌肌球蛋白結合蛋白C3；這蛋白可不簡單，在心肌細胞訊息傳導路徑上扮演著重要角色。不僅維持了心肌結構，更能調節心肌收縮與舒張的功能。Mitalipov 實驗室採樣了受試者的皮膚細胞、血液、與精細胞。皮膚細胞可以被培養成誘導多功能幹細胞（induced pluripotent stem cells），提供了另一個絕佳的實驗角度。
研究人員發現，注射 CRISPR/Cas9 到胚胎細胞的時間點很重要。他們剛開始的時候，在卵細胞受精之後的 18 小時注射CRISPR/Cas9、以及一小片段的 DNA 模板，讓細胞能夠一樣畫葫蘆的按照模板上的序列修改基因突變。三天後，當受精卵分裂為四到八個細胞的囊胚細胞期，研究人員再取出來分析。控制組的胚胎細胞，正常與帶有基因變異的機率如預期，各是一半一半（因為受試者兩個對偶基因，一個正常，一個突變）。但注射 CRISPR/Cas9 與 DNA 模板的實驗組，正常胚胎比率增加到 66%。但科學家所煩惱的夢魘三也成真，有四分之一的胚胎細胞鑲嵌了許多不同的突變。
後來，當研究人員採取另一個策略，在注射精細胞的時候，連同 CRISPR/Cas9 與 DNA 模板，一起注射到停留於第二次減數分裂中期的卵細胞（metaphase II-stage oocytes），三天後再分析胚胎細胞。這時候，有高達七成的胚胎細胞都是正常，而且其他的胚胎細胞，沒有發現鑲嵌不同突變的問題。而且，他們定序了幾個經程式預測，可能是脫靶效應高危險群的基因，也都沒有被 CRISPR/Cas9 亂槍打鳥而波及的跡象。
乍看之下，只要注射 CRISPR/Cas9 的時間拿捏得好，編輯基因來修復導致遺傳疾病的基因突變，不是不可行。但 Mitalipov 的實驗結果有一點很出乎意料，這也成了他們研究結果中，惹人皺眉抓不頭也想不懂的事。
記得他們在注射 CRISPR/Cas9 的時候，也夾帶了一段 DNA 模板，讓細胞在進行 DNA 序列修復的時候可以參照嗎？在那段模板裡，他們更改了 DNA 序列，讓製造出來的蛋白質跟正常蛋白質雖然一模一樣，但可以跟人類基因序列有所區隔。他們所分析的所有胚胎細胞，沒有一個用了他們的模板，反而是用了來自卵細胞的 DNA 序列。但他們同時在由病人皮膚細胞所培養出來的誘導多功能幹細胞實驗裡，卻幾乎都使用了挾帶的、更改過的 DNA 為作為修復模板。
Mitalipov 實驗室懷疑這可能是人類受精卵有不同於一般細胞的基因修復機制。但其他基因學家，卻擔心這也可能是 Mitalipov 實驗室的分析出了問題，以至於實驗成功只是一場美麗的誤會。許多基因學家考量的點在於，在精卵受精後，各自的 DNA 要等到約一天之後才會有可能近距離碰在一起。如果在這之前，卵細胞的 DNA 和精細胞的 DNA 都無法碰頭，那來自精細胞 DNA 的基因變異，要如何能夠利用卵細胞 DNA 上的正常序列來當作模板，進行基因修復呢？
Mitalipov 的實驗成功，或許跨出了利用基因編輯技術來治療遺傳性疾病的第一步，但實驗結果也有許多的眉角需要更多的腦力激盪，被提出的質疑也需要好好討論。但不論如何，後續發展還是很令人期待的！
原始論文：
Mitalipov實驗室的人類胚胎基因修正論文：Ma H, et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Nature. 2017 Aug 24;548(7668):413-419. doi: 10.1038/nature23305. Epub 2017 Aug 2. PMID: 28783728
質疑 Mitalipov 實驗室結果可能是分析失誤的討論：Dieter Egli, et al. Inter-homologue repair in fertilized human eggs? bioRxiv 181255; doi: https://doi.org/10.1101/181255
參考資料：
- Chandrasegaran S, et al. Genome editing of human embryos: to edit or not to edit, that is the question. J Clin Invest. 2017 Aug 28. pii: 96962. doi: 10.1172/JCI96962. PMID: 28846073
- Winblad N, et al. Biotechnology: At the heart of gene edits in human embryos. Nature. 2017 Aug 24;548(7668):398-400. doi: 10.1038/nature23533. Epub 2017 Aug 2.
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作者：駱宛琳 美國聖路易華盛頓大學（Washington University in St. Louis）免疫學博士，從事T細胞發育與活化相關的訊息傳導研究。
