【CRISPR baby 系列之二】為什麼CCR5 基因是賀建奎眼裡的西施?

■第一對基因編輯寶寶,就這樣在眾人的驚愕中誕生了。中國南方科技大學副教授賀建奎,利用 CRISPR/Cas9 基因編輯技術,將這對雙胞胎體內的 CCR5 基因剔除,希望這對雙胞胎終其一生都不用擔心被 HIV 病毒感染。賀建奎的理由,在科學倫理前被痛批的體無完膚;那在科學學理面前呢?真如他所言一般,站得住腳嗎?

撰文|駱宛琳

賀建奎為什麼看上 CCR5?CCR5 無疑是對抗 HIV 病毒感染與治療後天免疫缺乏症候群的天王級角色。

早在 1983 年科學家篤定 HIV 是造成後天免疫缺乏症候群的罪魁禍首之前,就有許多研究人員發現 HIV 特別偏愛免疫系統裡的 CD4 T 細胞。HIV 病毒藉由本身表面的 gp120 與 gp41 兩種醣蛋白而得以入侵 T 細胞。HIV 病毒先靠 gp120 醣蛋白和 T 細胞的 CD4 接觸,兩相結合之後,會造成 gp120 構型上的改變,使其上頭的 V3 可變環區(variable 3 loop)能和另一個 T 細胞表面蛋白質(CCR5 或是 CXCR4)結合,進而使得 HIV 表面的 gp41 醣蛋白得以接觸到 T 細胞細胞膜,在其上打洞,好讓 HIV 把自己的遺傳物質感染到 T 細胞內。因此,HIV 病毒要感染 T 細胞,必須湊足 T 細胞有表達 CD4、與 CCR5(或是 CXCR4)的條件。

更讓科學家心動的是,1996 年四月時,美國紐約 The Rockefeller University 的 Richard Koup 教授在Nature Medicine期刊上發表一篇讓人眼睛發亮的論文。

Koup 教授實驗室招募一群曾經多次暴露於 HIV 病毒感染風險中、卻從未被感染的歐洲人,發現其中有兩個歐洲人的 CD4 T 細胞像是穿了防護罩一樣,對 HIV 病毒的抵抗力要比一般人強很多。但這防護罩也不是銅牆鐵壁:當 HIV 病毒量高到一定程度的時候、或是 HIV 病毒 V3 可變環區發生突變的時候,這兩位歐洲人的 CD4 T 細胞防護罩就會失去功能。而且,這兩位歐洲人的防護罩,只對需要靠 CCR5 感染 T 細胞的 HIV 病毒種有效(稱為 R5 病毒);對於另外一種需要靠 CXCR4 感染 T 細胞的 HIV 病毒(稱為 X4 病毒)、或是既可透過 CCR5 也可以靠 CXCR4 的病毒(X4R5病毒)亦是束手無策。

同年八月,Koup 教授實驗室乘勝追擊,和同事Nathaniel Landau 教授實驗室聯手,在 Cell 期刊上一起揭開了這兩位歐洲人的防護罩密技:他們的 CCR5 基因有突變過,比正常的基因序列少了 32 個鹼基對,使得基因突變處之後的基因編碼章法全亂,終止密碼子提早出現。因此,CCR5Δ32 所編碼的蛋白質在轉譯過程中提早碰到終止密碼子而大當機。而製造出來的 CCR5Δ32 蛋白質,不但因為這 32 個鹼基對的缺失,而成了短小晏嬰版,這晏嬰版 CCR5 還無法好好的表現在細胞表面。

CCR5 蛋白質的功能是什麼呢?簡單來說,CCR5 是 T 細胞表面重要的趨化因子受體(chemokine receptor)之一。趨化因子受體像是在免疫細胞身上裝了一個螞蟻的鼻子一樣,只要嗅到了一絲絲趨化因子(chemokine)的存在,就像螞蟻嗅到了糖的甜,會順著趨化因子的濃度梯度,直直往濃度高的地方飛奔而去。CCR5 在未經世事的 T 細胞表面不太表現,但是只要 T 細胞被活化之後,CCR5 就像戰士勳章一樣,會被 T 細胞驕傲地一直別在門面上。而且,除了 T 細胞,CCR5 也能在自然殺手細胞(natural killer cells)與許多抗原呈現細胞身上找到;像是樹突細胞(dendritic cells)、巨噬細胞(macrophages)。免疫系統藉著調節趨化因子的種類,就有如握了遙控器在手,能像掌握遙控飛機一樣調節特定的 T 細胞要往哪裡去、該往哪裡去。不同的趨化因子與其受體在 T 細胞發育、急性發炎等情況裡,都各自扮演著重要角色。至今,大約有二十種趨化因子受體、五十種趨化因子被發現。

所以,這兩個歐洲人身上所發現的 CCR5Δ32 突變基因會讓 CCR5 蛋白質無法表現在細胞表面,無法偵測到 CCR5 相對應的趨化因子,也因此對 HIV 病毒中的 R5 病毒株有 較強的抵抗力(但不是絕對的抵抗力)。在歐洲與美洲,大概有 10 % 的人帶有一個突變的 CCR5-Δ32,像論文中那兩個歐洲人一樣同時兩個等位基因都是突變 CCR5-Δ32 基因的,大概只有 1 %。但是,只帶一個CCR5Δ32 突變基因的人,因為另一股 DNA 的基因序列仍然是編碼著完整的 CCR5 序列,對 HIV 病毒並沒有防護作用。不過,在被感染之後,疾病惡化的進程,會比一般人要稍微緩慢一些。

但,演化而來的天下,絕對沒有白吃的午餐。有研究發現,當兩個等位基因都是 CCR5Δ32時,這些人反而比較容易受到其他病毒的感染,像是流行感冒病毒、西尼羅病毒;感染之後也比一般人病情嚴重,並有較高的死亡率。甚至,CCR5Δ32也被發現是可能造成膽囊癌與子宮頸癌的危險因子之一。不少流行病學的研究分析也將精力投注於 CCR5Δ32 基因與第二型糖尿病、氣喘與多發性硬化症之間的關係,但 CCR5Δ32 基因型對這些疾病的影響力仍未有十足定論。

調控 CCR5 會是治癒後天免疫缺乏症候群的終極武器嗎?

2006 年時,有個被 HIV 病毒感染的「柏林病患」 Timothy Ray Brown,在有效控制病情十一年之後,發現自己罹患急性骨髓白血病。化療失效之後,Brown 決定接受造血幹細胞骨髓移植。考量到他的病情,加上幸運之神的眷顧,Brown 的醫生 Gero Hutter成功為他找到一位匹配的骨髓捐贈者,其兩個等位基因都是突變的 CCR5Δ32 。而 Brown 也自此,成了第一個「被治癒」的後天免疫缺乏症候群患者。

但之後的臨床研究卻也發現,這位「柏林病患」的傳奇,並不是單純黑點到黑點、兩點連連看那樣的簡單。可能是在接受骨髓移植前的全身放射治療很重要;可能是在接受移植之後所引發的移植物抗宿主反應,對消滅原本體內的被感染免疫細胞很重要;唯一可以肯定的,是即使找到了適合的 CCR5Δ32 造血幹細胞骨髓捐贈者,就連科學之神也無法拍胸脯保證病人之後不會再復發 HIV 感染。

但,就算無法拍板定案到底怎樣的治療策略才能重現柏林病患奇蹟,CCR5 依然是在臨床試驗中,讓科學家與醫療人員在不斷摸黑前進的過程裡,最高高掛著的領路燈。也已經有作用在 CCR5 的拮抗劑藥物問世:像是 2007 年被 FDA 核准上市的 maraviroc,可以藉由阻斷 CCR5,有效控制由HIV R5 病毒株所造成的後天免疫不全症。其他有類似功能的小分子藥物 (vicriviroc、cenicriviroc)也在不同的臨床試驗階段。

思量此,不難想像賀建奎為什麼會看上 CCR5。

賀建奎也不是唯一對 CCR5 有興趣的人。許多臨床研究,也希望可以藉由調控 CCR5 在細胞表面的表現,來控制 HIV 病毒的感染。但賀見奎似乎想錯了最重要的一件事:冤有頭、債有主,連不是自己的藥都不能亂吃,在 CCR5 和後天免疫不全症候群的臨床試驗裡,到底誰才是真正能夠被這些研究新知所幫助到的人呢? 

我們先來看看其他科學家怎麼做的好了。

2014 年時,由美國 University of Pennsylvania 的 Carl June 教授所主持的一起小規模臨床試驗,想要探討是不是可以利用病人自體的 CD4 T 細胞,藉由另一種基因編輯技術——鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases),將 CCR5 基因做更動,來達到類似於在 Brown 病人身上的治療效果。利用病人自體的 CD4 T 細胞有個好處,即不用擔心免疫排斥的問題。這個臨床實驗總共收了 12 個 HIV 患者,旨在研究實驗設計的安全性與可行性。當病人的 CCR5 基因被編輯之後,病人體內的 HIV 病毒量在長達一年的觀察其內,均穩定下降。甚至其中有一個病人的體內,不再偵測的到病毒。

類似 Carl June 教授的臨床實驗也不少,但,都不見有科學家意圖用精卵細胞來達到治療後天免疫不全症。畢竟,HIV 病毒的攻擊對象是 CD4 T 細胞,就算要將 CD4 T 細胞打掉重練,靠幹細胞骨髓移植也能夠將病人體內的 T 細胞汰換如新。像 Carl June 教授這樣,以病人體內的免疫細胞為主進行基因編輯,才正是對症下藥、利用最新的研究新知,幫助到最需要幫助的人。

而賀建奎的臨床實驗呢?在他主導的臨床試驗裡,不僅是在受精卵的階段更動了 CCR5 的基因序列,還一更動就全身所有細胞都連坐,更會遺傳到露露與娜娜的下一代。而且,賀建奎利用 Cas9/CRISPR 技術,讓 DNA 雙股斷在靠近 CCR5Δ32 突變的位置,卻沒有成功讓基因修復機制將斷裂的序列,修復成 CCR5Δ32 的樣子。

雖然說,先前研究普遍認為 CCR5Δ32 能夠對抗 HIV 病毒感染,是因為被斷腳之後的短小版蛋白質,無法穩定地表現在細胞表面。但是,蛋白質的調控本身就是一件複雜的事。晏嬰版 CCR5Δ32 沒有正常功能,卻無法一竿子打翻一條船,保證所有缺腳、短小版的 CCR5 都不中用,都無法在細胞表面穩穩站好。讓受精卵內的 CCR5 基因序列被修改成為從未經研究過的基因序列,本身就是一種風險。

賀建奎或許是認為,既然 CCR5Δ32 無法被表現在細胞表面,那豈不就跟剔除 CCR5 基因是殊途同歸的事。但如果真想要牙一咬、心一橫,一不做二不休的把 CCR5 基因剔除掉,讓蛋白質絕對無法被表現,通常也會選擇比較靠近基因序列前端的位置,讓 CCR5 蛋白質的合成一被啟動,旋即就碰到終止密碼子而被扼殺於早期,不會選擇偏基因中後端的位置,徒增變數。再者,基因剔除 CCR5 真能夠像 CCR5Δ32 的孿生兄弟一樣嗎?還是,會不會有其他變數呢?除了在免疫細胞上表現,CCR5 也可以在大腦組織裡許多部位的神經細胞中發現其蹤跡。近來,也有研究指出 CCR5 在大腦發育上可能扮演著重要角色。在嬰兒出生後到九個月的時間裡,CCR5 的表現逐漸增加,其活化後的訊息傳遞也和神經細胞的發育、增生有關。不過,在小鼠身上剔除掉了 CCR5 基因之後,小鼠的學習能力和記憶也都被發現有所增進。CCR5 在生理功能上的複雜程度,不是一句「為了防患 HIV 於未然」就能夠讓賀見奎膽將這樣的臨床實驗付諸實行的事。

 

原始論文:

最先發現 CCR5Δ32 能夠增加對抗 HIV 感染風險的論文:

  1. Paxton WA et al. Relative resistance to HIV-1 infection of CD4 lymphocytes from persons who remain uninfected despite multiple high-risk sexual exposure. Nat Med. 1996 Apr;2(4):412-7.
  2. Liu R et al. Homozygous defect in HIV-1 coreceptor accounts for resistance of some multiply-exposed individuals to HIV-1 infection. Cell. 1996 Aug 9;86(3):367-77.

接受 CCR5Δ32 血液幹細胞骨髓移植而治癒後天免疫不全症的病人案例:Hütter G et al. Long-term control of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 stem-cell transplantation. N Engl J Med. 2009 Feb 12;360(7):692-8. doi: 10.1056/NEJMoa0802905.

 Carl June 教授實驗室的CCR5 相關臨床計畫:Tebas P et a. Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV. N Engl J Med. 2014 Mar 6;370(10):901-10. doi: 10.1056/NEJMoa1300662.

 現在進行中的 CCR5 基因編輯相關臨床計畫(多是利用鋅指核酸酶技術):

  1. NCT00842634: Autologous T-Cells Genetically Modified at the CCR5 Gene by Zinc Finger Nucleases SB-728 for HIV (Zinc-Finger). https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00842634
  2. NCT01044654: Phase 1 Dose Escalation Study of Autologous T-cells Genetically Modified at the CCR5 Gene by Zinc Finger Nucleases in HIV-Infected Patients. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01044654
  3. NCT01252641: Study of Autologous T-cells Genetically Modified at the CCR5 Gene by Zinc Finger Nucleases in HIV-Infected Subjects. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01252641
  4. NCT01543152: Dose Escalation Study of Cyclophosphamide in HIV-Infected Subjects on HAART Receiving SB-728-T. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01543152
  5. NCT02225665: Repeat Doses of SB-728mR-T After Cyclophosphamide Conditioning in HIV-Infected Subjects on HAART. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02225665
  6. NCT02388594: A Phase I Study of T-Cells Genetically Modified at the CCR5 Gene by Zinc Finger Nucleases SB-728mR in HIV-Infected Patients. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02388594
  7. NCT02500849: Safety Study of Zinc Finger Nuclease CCR5-modified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells in HIV-1 Infected Patients. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02500849

剔除 CCR5 基因可能增進小鼠在學習與記憶中的表現:Zhou M et al. CCR5 is a suppressor for cortical plasticity and hippocampal learning and memory. Elife. 2016 Dec 20;5. pii: e20985. doi: 10.7554/eLife.20985.

 參考資料:

  1. Cornu TI et al. Refining strategies to translate genome editing to the clinic. Nat Med. 2017 Apr 3;23(4):415-423. doi: 10.1038/nm.4313.
  2. Venuti A et al. The Role of Natural Antibodies to CC Chemokine Receptor 5 in HIV Infection. Front Immunol. 2017 Oct 30;8:1358. doi: 10.3389/fimmu.2017.01358. eCollection 2017.
  3. Martin-Blondel G et al. CCR5 blockade for neuroinflammatory diseases--beyond control of HIV. Nat Rev Neurol. 2016 Feb;12(2):95-105. doi: 10.1038/nrneurol.2015.248. Epub 2016 Jan 18.
  4. Sorce S et al. The chemokine receptor CCR5 in the central nervous system. Prog Neurobiol. 2011 Feb;93(2):297-311. doi: 10.1016/j.pneurobio.2010.12.003. Epub 2010 Dec 14. Review.
  5. Barmania F et al. C-C chemokine receptor type five (CCR5): An emerging target for the control of HIV infection. Appl Transl Genom. 2013 May 26;2:3-16. eCollection 2013 Dec 1.

 

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作者:駱宛琳 美國聖路易華盛頓大學(Washington University in St. Louis)免疫學博士,從事T細胞發育與活化相關的訊息傳導研究。

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