【CRISPR baby 系列之二】為什麼CCR5 基因是賀建奎眼裡的西施？

■第一對基因編輯寶寶，就這樣在眾人的驚愕中誕生了。中國南方科技大學副教授賀建奎，利用 CRISPR/Cas9 基因編輯技術，將這對雙胞胎體內的 CCR5 基因剔除，希望這對雙胞胎終其一生都不用擔心被 HIV 病毒感染。賀建奎的理由，在科學倫理前被痛批的體無完膚；那在科學學理面前呢？真如他所言一般，站得住腳嗎？

撰文｜駱宛琳

賀建奎為什麼看上 CCR5？CCR5 無疑是對抗 HIV 病毒感染與治療後天免疫缺乏症候群的天王級角色。

早在 1983 年科學家篤定 HIV 是造成後天免疫缺乏症候群的罪魁禍首之前，就有許多研究人員發現 HIV 特別偏愛免疫系統裡的 CD4 T 細胞。HIV 病毒藉由本身表面的 gp120 與 gp41 兩種醣蛋白而得以入侵 T 細胞。HIV 病毒先靠 gp120 醣蛋白和 T 細胞的 CD4 接觸，兩相結合之後，會造成 gp120 構型上的改變，使其上頭的 V3 可變環區（variable 3 loop）能和另一個 T 細胞表面蛋白質（CCR5 或是 CXCR4）結合，進而使得 HIV 表面的 gp41 醣蛋白得以接觸到 T 細胞細胞膜，在其上打洞，好讓 HIV 把自己的遺傳物質感染到 T 細胞內。因此，HIV 病毒要感染 T 細胞，必須湊足 T 細胞有表達 CD4、與 CCR5（或是 CXCR4）的條件。

更讓科學家心動的是，1996 年四月時，美國紐約 The Rockefeller University 的 Richard Koup 教授在Nature Medicine期刊上發表一篇讓人眼睛發亮的論文。

Koup 教授實驗室招募一群曾經多次暴露於 HIV 病毒感染風險中、卻從未被感染的歐洲人，發現其中有兩個歐洲人的 CD4 T 細胞像是穿了防護罩一樣，對 HIV 病毒的抵抗力要比一般人強很多。但這防護罩也不是銅牆鐵壁：當 HIV 病毒量高到一定程度的時候、或是 HIV 病毒 V3 可變環區發生突變的時候，這兩位歐洲人的 CD4 T 細胞防護罩就會失去功能。而且，這兩位歐洲人的防護罩，只對需要靠 CCR5 感染 T 細胞的 HIV 病毒種有效（稱為 R5 病毒）；對於另外一種需要靠 CXCR4 感染 T 細胞的 HIV 病毒（稱為 X4 病毒）、或是既可透過 CCR5 也可以靠 CXCR4 的病毒（X4R5病毒）亦是束手無策。

同年八月，Koup 教授實驗室乘勝追擊，和同事Nathaniel Landau 教授實驗室聯手，在 Cell 期刊上一起揭開了這兩位歐洲人的防護罩密技：他們的 CCR5 基因有突變過，比正常的基因序列少了 32 個鹼基對，使得基因突變處之後的基因編碼章法全亂，終止密碼子提早出現。因此，CCR5Δ32 所編碼的蛋白質在轉譯過程中提早碰到終止密碼子而大當機。而製造出來的 CCR5Δ32 蛋白質，不但因為這 32 個鹼基對的缺失，而成了短小晏嬰版，這晏嬰版 CCR5 還無法好好的表現在細胞表面。

CCR5 蛋白質的功能是什麼呢？簡單來說，CCR5 是 T 細胞表面重要的趨化因子受體（chemokine receptor）之一。趨化因子受體像是在免疫細胞身上裝了一個螞蟻的鼻子一樣，只要嗅到了一絲絲趨化因子（chemokine）的存在，就像螞蟻嗅到了糖的甜，會順著趨化因子的濃度梯度，直直往濃度高的地方飛奔而去。CCR5 在未經世事的 T 細胞表面不太表現，但是只要 T 細胞被活化之後，CCR5 就像戰士勳章一樣，會被 T 細胞驕傲地一直別在門面上。而且，除了 T 細胞，CCR5 也能在自然殺手細胞（natural killer cells）與許多抗原呈現細胞身上找到；像是樹突細胞（dendritic cells）、巨噬細胞（macrophages）。免疫系統藉著調節趨化因子的種類，就有如握了遙控器在手，能像掌握遙控飛機一樣調節特定的 T 細胞要往哪裡去、該往哪裡去。不同的趨化因子與其受體在 T 細胞發育、急性發炎等情況裡，都各自扮演著重要角色。至今，大約有二十種趨化因子受體、五十種趨化因子被發現。

所以，這兩個歐洲人身上所發現的 CCR5Δ32 突變基因會讓 CCR5 蛋白質無法表現在細胞表面，無法偵測到 CCR5 相對應的趨化因子，也因此對 HIV 病毒中的 R5 病毒株有 較強的抵抗力（但不是絕對的抵抗力）。在歐洲與美洲，大概有 10 % 的人帶有一個突變的 CCR5-Δ32，像論文中那兩個歐洲人一樣同時兩個等位基因都是突變 CCR5-Δ32 基因的，大概只有 1 %。但是，只帶一個CCR5Δ32 突變基因的人，因為另一股 DNA 的基因序列仍然是編碼著完整的 CCR5 序列，對 HIV 病毒並沒有防護作用。不過，在被感染之後，疾病惡化的進程，會比一般人要稍微緩慢一些。

但，演化而來的天下，絕對沒有白吃的午餐。有研究發現，當兩個等位基因都是 CCR5Δ32時，這些人反而比較容易受到其他病毒的感染，像是流行感冒病毒、西尼羅病毒；感染之後也比一般人病情嚴重，並有較高的死亡率。甚至，CCR5Δ32也被發現是可能造成膽囊癌與子宮頸癌的危險因子之一。不少流行病學的研究分析也將精力投注於 CCR5Δ32 基因與第二型糖尿病、氣喘與多發性硬化症之間的關係，但 CCR5Δ32 基因型對這些疾病的影響力仍未有十足定論。

調控 CCR5 會是治癒後天免疫缺乏症候群的終極武器嗎？

2006 年時，有個被 HIV 病毒感染的「柏林病患」 Timothy Ray Brown，在有效控制病情十一年之後，發現自己罹患急性骨髓白血病。化療失效之後，Brown 決定接受造血幹細胞骨髓移植。考量到他的病情，加上幸運之神的眷顧，Brown 的醫生 Gero Hutter成功為他找到一位匹配的骨髓捐贈者，其兩個等位基因都是突變的 CCR5Δ32 。而 Brown 也自此，成了第一個「被治癒」的後天免疫缺乏症候群患者。

但之後的臨床研究卻也發現，這位「柏林病患」的傳奇，並不是單純黑點到黑點、兩點連連看那樣的簡單。可能是在接受骨髓移植前的全身放射治療很重要；可能是在接受移植之後所引發的移植物抗宿主反應，對消滅原本體內的被感染免疫細胞很重要；唯一可以肯定的，是即使找到了適合的 CCR5Δ32 造血幹細胞骨髓捐贈者，就連科學之神也無法拍胸脯保證病人之後不會再復發 HIV 感染。

但，就算無法拍板定案到底怎樣的治療策略才能重現柏林病患奇蹟，CCR5 依然是在臨床試驗中，讓科學家與醫療人員在不斷摸黑前進的過程裡，最高高掛著的領路燈。也已經有作用在 CCR5 的拮抗劑藥物問世：像是 2007 年被 FDA 核准上市的 maraviroc，可以藉由阻斷 CCR5，有效控制由HIV R5 病毒株所造成的後天免疫不全症。其他有類似功能的小分子藥物 （vicriviroc、cenicriviroc）也在不同的臨床試驗階段。

思量此，不難想像賀建奎為什麼會看上 CCR5。

賀建奎也不是唯一對 CCR5 有興趣的人。許多臨床研究，也希望可以藉由調控 CCR5 在細胞表面的表現，來控制 HIV 病毒的感染。但賀見奎似乎想錯了最重要的一件事：冤有頭、債有主，連不是自己的藥都不能亂吃，在 CCR5 和後天免疫不全症候群的臨床試驗裡，到底誰才是真正能夠被這些研究新知所幫助到的人呢？ 

我們先來看看其他科學家怎麼做的好了。

2014 年時，由美國 University of Pennsylvania 的 Carl June 教授所主持的一起小規模臨床試驗，想要探討是不是可以利用病人自體的 CD4 T 細胞，藉由另一種基因編輯技術——鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases），將 CCR5 基因做更動，來達到類似於在 Brown 病人身上的治療效果。利用病人自體的 CD4 T 細胞有個好處，即不用擔心免疫排斥的問題。這個臨床實驗總共收了 12 個 HIV 患者，旨在研究實驗設計的安全性與可行性。當病人的 CCR5 基因被編輯之後，病人體內的 HIV 病毒量在長達一年的觀察其內，均穩定下降。甚至其中有一個病人的體內，不再偵測的到病毒。

類似 Carl June 教授的臨床實驗也不少，但，都不見有科學家意圖用精卵細胞來達到治療後天免疫不全症。畢竟，HIV 病毒的攻擊對象是 CD4 T 細胞，就算要將 CD4 T 細胞打掉重練，靠幹細胞骨髓移植也能夠將病人體內的 T 細胞汰換如新。像 Carl June 教授這樣，以病人體內的免疫細胞為主進行基因編輯，才正是對症下藥、利用最新的研究新知，幫助到最需要幫助的人。

而賀建奎的臨床實驗呢？在他主導的臨床試驗裡，不僅是在受精卵的階段更動了 CCR5 的基因序列，還一更動就全身所有細胞都連坐，更會遺傳到露露與娜娜的下一代。而且，賀建奎利用 Cas9/CRISPR 技術，讓 DNA 雙股斷在靠近 CCR5Δ32 突變的位置，卻沒有成功讓基因修復機制將斷裂的序列，修復成 CCR5Δ32 的樣子。

雖然說，先前研究普遍認為 CCR5Δ32 能夠對抗 HIV 病毒感染，是因為被斷腳之後的短小版蛋白質，無法穩定地表現在細胞表面。但是，蛋白質的調控本身就是一件複雜的事。晏嬰版 CCR5Δ32 沒有正常功能，卻無法一竿子打翻一條船，保證所有缺腳、短小版的 CCR5 都不中用，都無法在細胞表面穩穩站好。讓受精卵內的 CCR5 基因序列被修改成為從未經研究過的基因序列，本身就是一種風險。

賀建奎或許是認為，既然 CCR5Δ32 無法被表現在細胞表面，那豈不就跟剔除 CCR5 基因是殊途同歸的事。但如果真想要牙一咬、心一橫，一不做二不休的把 CCR5 基因剔除掉，讓蛋白質絕對無法被表現，通常也會選擇比較靠近基因序列前端的位置，讓 CCR5 蛋白質的合成一被啟動，旋即就碰到終止密碼子而被扼殺於早期，不會選擇偏基因中後端的位置，徒增變數。再者，基因剔除 CCR5 真能夠像 CCR5Δ32 的孿生兄弟一樣嗎？還是，會不會有其他變數呢？除了在免疫細胞上表現，CCR5 也可以在大腦組織裡許多部位的神經細胞中發現其蹤跡。近來，也有研究指出 CCR5 在大腦發育上可能扮演著重要角色。在嬰兒出生後到九個月的時間裡，CCR5 的表現逐漸增加，其活化後的訊息傳遞也和神經細胞的發育、增生有關。不過，在小鼠身上剔除掉了 CCR5 基因之後，小鼠的學習能力和記憶也都被發現有所增進。CCR5 在生理功能上的複雜程度，不是一句「為了防患 HIV 於未然」就能夠讓賀見奎膽將這樣的臨床實驗付諸實行的事。

 

原始論文：

最先發現 CCR5Δ32 能夠增加對抗 HIV 感染風險的論文：

1. Paxton WA et al. Relative resistance to HIV-1 infection of CD4 lymphocytes from persons who remain uninfected despite multiple high-risk sexual exposure. Nat Med. 1996 Apr;2(4):412-7.
2. Liu R et al. Homozygous defect in HIV-1 coreceptor accounts for resistance of some multiply-exposed individuals to HIV-1 infection. Cell. 1996 Aug 9;86(3):367-77.

接受 CCR5Δ32 血液幹細胞骨髓移植而治癒後天免疫不全症的病人案例：Hütter G et al. Long-term control of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 stem-cell transplantation. N Engl J Med. 2009 Feb 12;360(7):692-8. doi: 10.1056/NEJMoa0802905.

 Carl June 教授實驗室的CCR5 相關臨床計畫：Tebas P et a. Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV. N Engl J Med. 2014 Mar 6;370(10):901-10. doi: 10.1056/NEJMoa1300662.

 現在進行中的 CCR5 基因編輯相關臨床計畫（多是利用鋅指核酸酶技術）:

1. NCT00842634: Autologous T-Cells Genetically Modified at the CCR5 Gene by Zinc Finger Nucleases SB-728 for HIV (Zinc-Finger). https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00842634
2. NCT01044654: Phase 1 Dose Escalation Study of Autologous T-cells Genetically Modified at the CCR5 Gene by Zinc Finger Nucleases in HIV-Infected Patients. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01044654
3. NCT01252641: Study of Autologous T-cells Genetically Modified at the CCR5 Gene by Zinc Finger Nucleases in HIV-Infected Subjects. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01252641
4. NCT01543152: Dose Escalation Study of Cyclophosphamide in HIV-Infected Subjects on HAART Receiving SB-728-T. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01543152
5. NCT02225665: Repeat Doses of SB-728mR-T After Cyclophosphamide Conditioning in HIV-Infected Subjects on HAART. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02225665
6. NCT02388594: A Phase I Study of T-Cells Genetically Modified at the CCR5 Gene by Zinc Finger Nucleases SB-728mR in HIV-Infected Patients. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02388594
7. NCT02500849: Safety Study of Zinc Finger Nuclease CCR5-modified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells in HIV-1 Infected Patients. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02500849

剔除 CCR5 基因可能增進小鼠在學習與記憶中的表現：Zhou M et al. CCR5 is a suppressor for cortical plasticity and hippocampal learning and memory. Elife. 2016 Dec 20;5. pii: e20985. doi: 10.7554/eLife.20985.

 參考資料：

1. Cornu TI et al. Refining strategies to translate genome editing to the clinic. Nat Med. 2017 Apr 3;23(4):415-423. doi: 10.1038/nm.4313.
2. Venuti A et al. The Role of Natural Antibodies to CC Chemokine Receptor 5 in HIV Infection. Front Immunol. 2017 Oct 30;8:1358. doi: 10.3389/fimmu.2017.01358. eCollection 2017.
3. Martin-Blondel G et al. CCR5 blockade for neuroinflammatory diseases--beyond control of HIV. Nat Rev Neurol. 2016 Feb;12(2):95-105. doi: 10.1038/nrneurol.2015.248. Epub 2016 Jan 18.
4. Sorce S et al. The chemokine receptor CCR5 in the central nervous system. Prog Neurobiol. 2011 Feb;93(2):297-311. doi: 10.1016/j.pneurobio.2010.12.003. Epub 2010 Dec 14. Review.
5. Barmania F et al. C-C chemokine receptor type five (CCR5): An emerging target for the control of HIV infection. Appl Transl Genom. 2013 May 26;2:3-16. eCollection 2013 Dec 1.

 

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作者：駱宛琳　美國聖路易華盛頓大學（Washington University in St. Louis）免疫學博士，從事T細胞發育與活化相關的訊息傳導研究。