基因編輯技術CRISPR和TALEN的比較

CRISPR是革命性的基因編輯技術，可協助人類改寫DNA編碼，應用範圍十分廣泛，包括農產品、食品、環保及生醫等領域。另一種基因編輯技術TALEN是經人工改造的限制性內切酶，可對DNA位點進行辨識、標靶與編輯，識別DNA序列的能力與Cas9相似，但二者作用方式不同。近年，全球科學家為增加基因編輯的精準度與效率，已投入了大量時間、人力及資本，評估除CRISPR以外其他基因編輯工具的可行性，我們在本文將簡介CRISPR及TALEN兩種基因編輯技術的特點，並對其作比較。

撰文｜陳淵銓

●CRISPR的特點

外來的質體或病毒（噬菌體）DNA首次進入細菌後並未被完全分解，經加工後可嵌入細菌基因體而被稱為 CRISPR 陣列（array），此特殊區段能夠轉錄訊息 RNA（messenger RNA, mRNA），而具有切割 DNA 活性的 Cas9 蛋白（限制內切酶）則會利用 mRNA 片段去辨認互補性的 DNA 片段，並切除符合序列的標的物。單股導引 RNA （single-guiding RNA, sgRNA）會與宿主特定的 DNA序列及Cas 9蛋白結合，其中 sg RNA 的 protospacer 序列（17－20 個核苷酸）負責辨識專一性的 DNA 序列，Cas9 蛋白質則會辨認 protospacer 序列鄰近的區域（protospacer adjacent motif, PAM）上游 3 個核苷酸的位點，利用核酸內切酶使標的 DNA 產生雙股斷裂（double-stranded break, DSB）。因此，修改 sgRNA 序列，即可改變 Cas9 蛋白的專一性，使其裁切另一不同序列的 DNA。與傳統的基因編輯技術相較，CRISPR 現今受到最廣泛採用，主要是因其同時具有下列優點：

1.無物種限制：動物、植物及微生物等生物均適用此技術進行基因編譯。

2.簡單：基因標靶點（target site）搜尋容易，PAM位點 (NGG) 平均於128 鹼基對（base pair, bp）隨機 DNA 序列中就會出現一次，且DNA正反兩股皆可設計，質體構築失敗率低，Cas9蛋白辨識效率高。

3.準確：利用RNA與DNA互補性鹼基配對（complementary base pairing）的原理，sgRNA可以正確的辨認標的DNA序列，還可同時放入2個以上的sgRNA 來達成同時剔除多個基因的目的。

4.迅速：使用時僅需合成特定序列的DNA，較製造重組蛋白更為穩定且較有效率；雙合一或三合一載體簡化細胞轉染（transfection）的難度，再配合報導基因（reporter gene）的表現，如螢光蛋白或抗生素篩選基因，可使篩選更加迅速。

5.經濟：製作材料僅有引子（primer）、質體及簡單的酵素，所需成本較傳統方法為低。

●TALEN的特點

轉錄激活因子樣作用子（transcription activator-like effector, TALE）是由柑橘潰瘍菌（Xanthomonas）感染植物時第三型分泌系統（type III secretion system）分泌的蛋白質。每個 TALE都包含一個中央重複區域，該區域由34個胺基酸的不同數量的重複單元組成，其中32個胺基酸是保守且穩定的（conserved and stable），只有第12和13個胺基酸是可變的（variable），這兩個位置-RVDs（repeat variable di-residues）各以不同的頻率來識別特定的核苷酸，亦即2個胺基酸辨識1個核苷酸，例如：NI （asparagine-isoleucine）識別A (adenine, 55％），NG（asparagine-glycine）識別T（thymine, 50％），NN（asparagine- asparagine-isoleucine）識別G（guanine, 7％）和HD（histidine-aspartic acid）識別C（cytosine, 69％）。限制性核酸內切酶Fok I由N端特異性DNA結合結構域和C端非特異性DNA切割結構域組成，切割位置在識別位下游第9和13個核苷酸處而形成雙股DNA斷裂。TALEN（transcription activator-like effectors nuclease）是一種由專一性的TALE DNA 結合結構域與非專一性的Fok I DNA切割結構域融合而產生的人工限制酵素（artificial restriction enzyme）。

在2021年，美國研究人員利用顯微鏡與單分子顯像技術（single-molecule imaging）比較TALEN與CRISPR在哺乳動物的活體細胞中的表現，發現TALEN在緊密折疊的異染色質（heterochromatin）區域的辨識效率要較CRISPR高出5倍，而且基因編輯效率亦較CRISPR為高，但是在未折疊且通常在轉錄中的真染色質（euchromatin）區域，則CRISPR表現較佳。研究結果顯示若應用在異染色質上，TALEN是比Cas9更有效的基因編輯工具。他們推測會出現這種差異的原因可能是兩種基因編輯技術尋找標靶位點的方式不同，TALEN同時使用局部區域搜尋（local search）及三度空間擴散（3D diffusion）兩種方式來定位目標位點，但是CRISPR 僅依靠局部區域蒐尋。這個結果具有下列重要意義：

1.以往被認為難以改造的異染色質DNA將可利用TALEN來進行編輯，深具潛力用於治療相關疾病，如易脆性X染色體症候群（fragile-X syndrome）及鐮狀型細胞貧血症（sickle cell anemia）等。

2.不同的基因編輯技術根據不同的原理進行作用，可以適用於針對不同基因體區域進行編輯，且各有其擅長之處，另外可能有更多的基因編輯工具尚待開發，能用於改善現有技術的精準度及效率。

表一：TALEN與CRISPR的比較