基因編輯技術CRISPR重要發展歷程的回顧

2020年度諾貝爾化學獎已揭曉由基因編輯技術CRISPR發明者珍妮佛.杜德納(Jennifer Doudna)及埃馬紐埃爾.彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)共同獲得。CRISPR技術有「上帝的手術刀」之稱,使研究人員可以精準且快速的對生物體(動物、植物及微生物)的基因進行編輯。目前CRISPR已廣泛用於基礎研究,並成功用於生產農產品及食品,而且技術逐漸成熟而可能應用於生產醫藥品及其他產品,其多方面應用的潛力引起各界重視,我們在本文將回顧這項技術的重要發展歷程。

圖片來源: Pixabay

撰文/陳淵銓

●CRISPR 的認識

叢集有規律間隔的短迴文重複序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)是存於細菌中的基因組,此基因組含有曾入侵過該細菌的病毒的外來基因片段,而形成存於原核生物的後天免疫(adaptive immunity)系統,細菌通過這些基因片段來偵測及抵禦類似病毒的攻擊,並破壞其DNA。這類基因組是細菌免疫系統的關鍵組成部分,研究人員可以藉由這類基因組準確而有效地編輯生物體內部分基因,現在已發展成一種成熟且穩定的基因編輯技術(gene editing)技術,廣泛應用在生物體的基因改造。

●CRISPR的起源及發現

在1987年,日本研究人員分析大腸桿菌含有iap (isozyme conversion of alkaline phosphatase)基因的染色體片段序列 1664個核苷酸和鑑定基因產物,在報告中首次提到原核生物核區(nucleoid) DNA序列中的直接有間隔的重複序列(direct repeat-sequences with nucleotides as spacing),現今被稱為CRISPR。

在2000年,西班牙研究人員在研究古細菌、細菌及粒線體基因組時,發現相似的重複序列出現在古細菌和細菌的基因組中,並將之命名為短間隔重複序列(short regularly spaced repeats, SRSR)。

在2002年,荷蘭研究人員在鑑定原核生物中與DNA重複子相關的基因時,SRSR被重新命名為CRISPR,其中一部分基因編碼的蛋白為核酸酶(nuclease)和解旋酶(gyrase),這些CRISPR關聯蛋白(CRISPR-associated protein, Cas)與CRISPR組成了CRISPR/Cas系統。

在2010年,法國研究人員發表於國際著名期刊「科學(Science )」:CRISPR原本是一種原核生物(細菌)為了對抗外來遺傳物質,如質體(plasmid)或噬菌體(bacteriophage)的DNA,而在宿主體內產生的後天免疫系統,細菌會對曾侵入的DNA產生記憶(memory),當序列相同的DNA再次進入細菌時,會產生後天性免疫反應以分解此外來的DNA。

●CRISPR技術在改善使用安全性的重要發展

CRISPR雖然是當前基因編輯技術的主流,但仍無法實現一些安全性要求較高的工程,以CRISPR/Cas9為例,雖然科學家可以引導 Cas9 蛋白去切開一段特定的 DNA,但卻只能依靠細胞自身的DNA修復機制來進行修補,造成發生不可預測性的變異。此外,先前的研究已知要提高CRISPR技術用於人體治療的成功率,須同時抑制p53蛋白的活化,但可能會相對增加罹癌的風險,故必須進行更多使用安全性研究。胞嘧啶(cytosine)自發性的脫胺作用的C-G鹼基對轉變成T-A,已知會造成人體內的致病性點突變,故有效的將A-T鹼基對直接轉變為G-C而無須切割DNA,將有助CRISPR技術用於疾病的治療。

台裔美籍科學家劉如謙(David Liu)團隊致力於研究CRISPR,開發出來的第二代技術從起初的DNA「剪刀」,變形為CRISPR 2.0的「鉛筆與橡皮擦」。在第一代的CRISPR技術中,CRISPR/Cas9的「剪刀」僅可插入或刪除部份DNA序列,但近來研究發現,剪切會引發細胞守門員p53蛋白自動修復或摧毀細胞,但關掉P53基因就少了把關者,難以偵測細胞變異甚至癌化的現象。第二代技術CRISPR 2.0的作用在於更精準的修改DNA序列,直接抽換鹼基ATCG裡的單點突變(single point mutation)以減少突變的機率及其他副作用。他們開發的鹼基編輯器(base editor)置換DNA序列的鹼基(例如由G換成A,C換成T),因而有「鉛筆與橡皮擦」的比喻。在2016年,他們發表了第一個鹼基編輯器,讓科學家首次能對活體細胞基因中單一鹼基對進行可預期性的修改;在2017年,該團隊再次打造出比CRISPR/Cas9更可靠的新基因編輯工具,能在不切割DNA的情況下,把 A-T 鹼基對直接轉換成G-C鹼基對,其中第7代adenine base editor(ABE)已能有效的將A-T鹼基對轉變成G-C,在人類細胞效率約有50%,作用產物純度高達99.9%,而嵌入和刪去(insertion and deletion)突變的比率則在0.1%,ABE較現行的Cas9 核酸酶(nuclease)方法在造成點突變時,更有效且脫靶(off target)效應更低。科學家已發現可在人類細胞培養中,在不產生雙股DNA斷裂(double strand break)的情況下,ABE可直接引發所有4種核苷酸的transition突變。因此,使用CRISPR技術治療疾病時便無須抑制 p53蛋白的活化,即可獲得很高的效率,亦提高了在人體內使用的安全性。

●CRISPR技術在改善作用侷限性的重要發展

使用CRISPR技術在基因組編輯的最重要限制是在標的位置須有與protospacer 序列鄰近的區域(protospacer adjacent motif, PAM)存在,而使得作用具有很大的侷限性。傳統上來自 Streptococcus pyogene的Cas9(SpCas9)所需的PAM是NGG。

在2018年,美國研究人員發現一種經過改造的Cas9變異種(variant),在哺乳動物細胞中所需的PAM不限於NGG,他們利用噬菌體開發了擴展型的PAM SpCas9變異種(xCas9),可辨認的較廣的PAM序列包含NG、GAA和GAT,儘管xCas9 辨認範圍較廣,但專一性卻較SpCas9 為高且具有實質較低的脫靶效應,這個發現不但擴大了CRISPR的DNA標靶作用範圍,無須權衡Cas9編輯效率、PAM可獲得性(compatibility)及作用於DNA專一性的重要性而須在其中選擇一個,提供了效率、可獲得性及專一性三者得而兼顧的可能性。

 

參考資料:

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