基因編輯技術CRISPR重要發展歷程的回顧

2020年度諾貝爾化學獎已揭曉由基因編輯技術CRISPR發明者珍妮佛．杜德納（Jennifer Doudna）及埃馬紐埃爾．彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）共同獲得。CRISPR技術有「上帝的手術刀」之稱，使研究人員可以精準且快速的對生物體（動物、植物及微生物）的基因進行編輯。目前CRISPR已廣泛用於基礎研究，並成功用於生產農產品及食品，而且技術逐漸成熟而可能應用於生產醫藥品及其他產品，其多方面應用的潛力引起各界重視，我們在本文將回顧這項技術的重要發展歷程。

撰文／陳淵銓

●CRISPR 的認識

叢集有規律間隔的短迴文重複序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）是存於細菌中的基因組，此基因組含有曾入侵過該細菌的病毒的外來基因片段，而形成存於原核生物的後天免疫（adaptive immunity）系統，細菌通過這些基因片段來偵測及抵禦類似病毒的攻擊，並破壞其DNA。這類基因組是細菌免疫系統的關鍵組成部分，研究人員可以藉由這類基因組準確而有效地編輯生物體內部分基因，現在已發展成一種成熟且穩定的基因編輯技術（gene editing）技術，廣泛應用在生物體的基因改造。

●CRISPR的起源及發現

在1987年，日本研究人員分析大腸桿菌含有iap （isozyme conversion of alkaline phosphatase）基因的染色體片段序列 1664個核苷酸和鑑定基因產物，在報告中首次提到原核生物核區（nucleoid） DNA序列中的直接有間隔的重複序列（direct repeat-sequences with nucleotides as spacing），現今被稱為CRISPR。

在2000年，西班牙研究人員在研究古細菌、細菌及粒線體基因組時，發現相似的重複序列出現在古細菌和細菌的基因組中，並將之命名為短間隔重複序列（short regularly spaced repeats, SRSR）。

在2002年，荷蘭研究人員在鑑定原核生物中與DNA重複子相關的基因時，SRSR被重新命名為CRISPR，其中一部分基因編碼的蛋白為核酸酶（nuclease）和解旋酶（gyrase），這些CRISPR關聯蛋白（CRISPR-associated protein, Cas）與CRISPR組成了CRISPR/Cas系統。

在2010年，法國研究人員發表於國際著名期刊「科學（Science ）」：CRISPR原本是一種原核生物（細菌）為了對抗外來遺傳物質，如質體（plasmid）或噬菌體（bacteriophage）的DNA，而在宿主體內產生的後天免疫系統，細菌會對曾侵入的DNA產生記憶（memory），當序列相同的DNA再次進入細菌時，會產生後天性免疫反應以分解此外來的DNA。

●CRISPR技術在改善使用安全性的重要發展

CRISPR雖然是當前基因編輯技術的主流，但仍無法實現一些安全性要求較高的工程，以CRISPR/Cas9為例，雖然科學家可以引導 Cas9 蛋白去切開一段特定的 DNA，但卻只能依靠細胞自身的DNA修復機制來進行修補，造成發生不可預測性的變異。此外，先前的研究已知要提高CRISPR技術用於人體治療的成功率，須同時抑制p53蛋白的活化，但可能會相對增加罹癌的風險，故必須進行更多使用安全性研究。胞嘧啶（cytosine）自發性的脫胺作用的C-G鹼基對轉變成T-A，已知會造成人體內的致病性點突變，故有效的將A-T鹼基對直接轉變為G-C而無須切割DNA，將有助CRISPR技術用於疾病的治療。

台裔美籍科學家劉如謙（David Liu）團隊致力於研究CRISPR，開發出來的第二代技術從起初的DNA「剪刀」，變形為CRISPR 2.0的「鉛筆與橡皮擦」。在第一代的CRISPR技術中，CRISPR/Cas9的「剪刀」僅可插入或刪除部份DNA序列，但近來研究發現，剪切會引發細胞守門員p53蛋白自動修復或摧毀細胞，但關掉P53基因就少了把關者，難以偵測細胞變異甚至癌化的現象。第二代技術CRISPR 2.0的作用在於更精準的修改DNA序列，直接抽換鹼基ATCG裡的單點突變（single point mutation）以減少突變的機率及其他副作用。他們開發的鹼基編輯器（base editor）置換DNA序列的鹼基（例如由G換成A，C換成T），因而有「鉛筆與橡皮擦」的比喻。在2016年，他們發表了第一個鹼基編輯器，讓科學家首次能對活體細胞基因中單一鹼基對進行可預期性的修改；在2017年，該團隊再次打造出比CRISPR/Cas9更可靠的新基因編輯工具，能在不切割DNA的情況下，把 A-T 鹼基對直接轉換成G-C鹼基對，其中第7代adenine base editor（ABE）已能有效的將A-T鹼基對轉變成G-C，在人類細胞效率約有50%，作用產物純度高達99.9%，而嵌入和刪去（insertion and deletion）突變的比率則在0.1%，ABE較現行的Cas9 核酸酶（nuclease）方法在造成點突變時，更有效且脫靶（off target）效應更低。科學家已發現可在人類細胞培養中，在不產生雙股DNA斷裂（double strand break）的情況下，ABE可直接引發所有4種核苷酸的transition突變。因此，使用CRISPR技術治療疾病時便無須抑制 p53蛋白的活化，即可獲得很高的效率，亦提高了在人體內使用的安全性。

●CRISPR技術在改善作用侷限性的重要發展

使用CRISPR技術在基因組編輯的最重要限制是在標的位置須有與protospacer 序列鄰近的區域（protospacer adjacent motif, PAM）存在，而使得作用具有很大的侷限性。傳統上來自 Streptococcus pyogene的Cas9（SpCas9）所需的PAM是NGG。

在2018年，美國研究人員發現一種經過改造的Cas9變異種（variant），在哺乳動物細胞中所需的PAM不限於NGG，他們利用噬菌體開發了擴展型的PAM SpCas9變異種（xCas9），可辨認的較廣的PAM序列包含NG、GAA和GAT，儘管xCas9 辨認範圍較廣，但專一性卻較SpCas9 為高且具有實質較低的脫靶效應，這個發現不但擴大了CRISPR的DNA標靶作用範圍，無須權衡Cas9編輯效率、PAM可獲得性（compatibility）及作用於DNA專一性的重要性而須在其中選擇一個，提供了效率、可獲得性及專一性三者得而兼顧的可能性。

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