聚合酶連鎖反應（PCR）發展的脈絡及歷程

聚合酶連鎖反應（Polymerase chain reaction, PCR）是一種簡單、廉價和可靠的複製DNA片段的方法，是目前分子生物學中最廣泛使用的技術，已被成功應用於生物醫學研究、犯罪取證、疾病診斷及分子考古學等領域 。PCR發展多年，技術逐漸成熟，並已演化出多種變體的PCR。我們將在本文中探索PCR發展的脈絡及歷程，並介紹三種世代的PCR（傳統擴增PCR、即時定量PCR及微滴式數字PCR）的作用、性質、特點及應用。

撰文／陳淵銓

●PCR的發展歷史

生物的DNA在活體外進行人工複製是一種耗時費事的程序，首先要將DNA經限制酶（restriction enzyme）裁剪，接者利用連接酶（ligase）加到適當的載體（vector）中，再利用轉形（transformation）的方法，如瞬間的電衝擊（electroporation）或熱休克（heat shock）等，將含有特定DNA片段的載體送到大腸桿菌勝任細胞（competent cell）中，再將此菌培養繁殖，經過分離及純化的步驟，才能大量複製DNA片段。

在1983年，凱利·穆利斯（Kary Mullis）開發PCR技術，並於1993年獲得諾貝爾化學獎，他利用DNA雙股複製的原理，使用DNA聚合酶用於體外試驗複製特定DNA片段，並在短期內大量擴增此片段。然而，在最初的PCR實驗中，穆利斯並非採用常溫來解開DNA雙鏈，而是把雙股DNA加熱到96℃，使其分離成為兩條DNA單鏈。在96℃下，因為大腸桿菌DNA聚合酶會被破壞，所以在每個循環的加熱步驟後均須補充新的酵素，並在整個過程中都需人工操作，造成PCR效率極低。

後來，研究人員改用自水生棲熱菌（Thermus aquaticus）分離出來的耐熱性DNA聚合酶（Taq DNA polymerase，最適作用溫度72 °C，由台灣科學家錢嘉韻於1976年在溫泉中發現）取代原本的大腸桿菌DNA聚合酶。由於Taq DNA聚合酶可耐高溫，故無需持續加入新的DNA聚合酶，使得反應過程變得簡單且可由機器操作，顯著提高了PCR的效率。然而，Taq DNA聚合酶所含的3'→5'核酸外切酶（exonuclease）活性缺乏校讀（proofreading）的能力，在DNA複製時容易發生錯誤，故又從其他細菌中獲得具有校讀功能的Pfu酶來降低突變率，Taq DNA聚合酶與Pfu酶的結合可以確保擴增DNA的準確性。

●PCR發展的三個世代

1. 第一世代：傳統擴增PCR（traditional amplification PCR）

在試管內將特定DNA片段，以專一性的連鎖反應，使得DNA片段數目以2的對數（2ⁿ）快速增加而產生大量的產物。所需的材料包含DNA模板（template）、界定複製起始點兩端的引子（primer）、 Taq DNA聚合酶、 合成原料核苷酸（nucleotide: A, G, T, C）及緩衝溶液，關鍵步驟則是 DNA變性（denaturation）、引子黏合（annealing）及引子延長（extension）。

2. 第二世代：即時定量PCR（quantitative real-time PCR）

用於即時檢測PCR產物的螢光染料標記在一段可與單股DNA模板進行專一性雜交的探針（如SyBR green或TaqMan probe）上，PCR儀的光學檢測系統記錄螢光信號強度，在某一循環中螢光信號的強度達到預先設定的閾值時，此時的循環數稱為Ct（threshold cycle）值或Cq（quantification cycle）值。Ct值與起始的DNA模板量成反比，起始的核酸量越多，達到閾值的循環數就越少，亦即Ct值會越小。以Ct值為縱坐標，起始模板數為橫坐標作出標準曲線，便可計算出待測DNA的複製數（copy number）。

3. 第三世代：微滴式數字PCR（droplet digital PCR）

將待測的標的核酸分子均勻稀釋後，分散至大量的微反應器或微油滴中，並使每個反應只有0或1個DNA模板，經PCR擴增後，有1個DNA模板就會產生螢光訊號，而0個的則不會有螢光訊號，再採用卜瓦松分布（Poisson distribution）的統計模式，以分析軟體計算出標的核酸的絕對定量（absolute quantification）。

表1. 三個世代的 PCR 之比較

參考資料：

1. Bartlett JMS, Stirling D. A Short History of the Polymerase Chain Reaction. PCR Protocols. Methods in Molecular Biology 226 2nd. 2003: 3–6. ISBN 1-59259-384-4. doi:10.1385/1-59259-384-4:3.
2. Mullis KB, Erlich HA, Arnheim N, Horn GT, Saiki RK, Scharf SJ. Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences. 1989 Jan. 24. 美國專利第4,683,195號 https://www.osti.gov/biblio/6254925-process-amplifying-detecting-cloning-nucleic-acid-sequences
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