微滴式數字聚合酶連鎖反應（DD PCR）的技術及應用

微滴式數字聚合酶連鎖反應（Droplet digital polymerase chain reaction, DD PCR）是一種數位化基因偵測系統，分別對標的分子進行PCR擴增後，再以螢光訊號進行統計分析，可偵測樣品的絕對DNA分子個數，對核酸分子進行絕對定量（absolute quantification），而不再只是相對定量（relative quantification）。DD PCR已克服了傳統PCR系統成本高、通量有限、流程複雜、精確度低等缺點，適用範圍十分廣泛，包括食品的檢測、環境的監測及疾病的診斷等。

撰文／陳淵銓

●微滴式數字聚合酶連鎖反應（DD PCR）的認識

DD PCR對樣品進行微滴化處理，使得待測核酸片段均勻的稀釋，意即將含有核酸分子的反應體系分成很多個微滴，再分散至大量的微反應器或微油滴中，每個微滴或含有1個待檢標的（target）核酸或不含待檢核酸。

標的核酸經PCR擴增後，再對每個微滴進行檢測，有螢光信號的微滴含有DNA模板判讀為1，沒有螢光信號的微滴不含DNA模板則判讀為0，根據卜瓦松分布（Poisson distribution）原理及陽性微滴的個數、比例，即可得出標的核酸的起始拷貝數（copy number）或濃度，再以軟體計算出標的核酸的絕對定量。

與傳統PCR（第一代）及即時定量PCR（第二代）相比，DD PCR（第三代）數據具有更高的準確度、精密度及靈敏度，而且無需內控制組（internal control）。因DD PCR靈敏度很高，故僅需要很少的模板量，可精確檢測微量及不易得到的樣品中的核酸，彌補了前兩代PCR難以精確測定基因拷貝數量、無法對微量突變定性或定量及精密度低等缺點，技術優勢如下：

1. 單分子分析：將微量樣本再細分成數萬個微滴，實現臨床樣本的單分子分析。
2. 真正的絕對定量：無需標準曲線，檢測下限可低至單拷貝數，可統計突變率；不依賴擴增效率，能克服PCR抑制劑的影響。
3. 不依賴Cq（quantification cycle）值：可確定偵測低至單拷貝待檢標的分子的絕對數目。Cq值：PCR擴增過程中，擴增產物（螢光信號）到達閾值（threshold value）所需的擴增循環次數。
4. 數據分析自動化：每個微滴的檢測結果以陰性或陽性標示，由儀器直接判讀，樣本被稀釋成許多部分，再於反應發生時計數，靈敏度可達001%，顯著高於擴增阻滯突變系統（0.1%）和Sanger測序法（10%）。
5. 使用靈活：可依實驗需要調整通量和靈敏度。

●七項DD PCR 的應用範圍

一、次世代定序（new generation sequencing, NGS）：無需使用標準曲線，直接對NGS檢體庫執行絕對定量分析。

二、基因表達分析（gene expression analysis）：對微量mRNA和miRNA的細微變化進行可靠的和可重複的檢測。

三、基因複製數量變異性檢測（copy number variation detection）：可準確測量核酸片段複製數量的變化。

四、超微量檢測（rare event detection）：可針對基因單點突變、核酸片段複製數目變化或核酸序列鹼基對的嵌入（insertion）或刪除（deletion）作超微量檢測，可以準確檢測到001%的突變（即時定量PCR靈敏度約為1％）。

五、基因表現分析（gene expression analysis）：基因表達差異區分倍數可達25X以下（即時定量PCR之有效區分的倍數為2X），尤其對低表現量的基因，都能達到更準確的定量。

六、病原體檢測（pathogen detection）：與相對定量的即時定量PCR比較，絕對定量的DD PCR能提供更高準確度與靈敏度的病原體載量（load）檢測結果。

七、次世代定序檢體庫的定量 (NGS library quantification)：檢測NGS檢體庫的核酸片段大小是否正確並予以定量，確認檢體是否適合上機，高靈敏度可提高上機的成功率。

●DD PCR 的臨床應用

DD PCR 現已臨床應用在疾病的診斷和監測，如癌症的早期篩檢、腫瘤繼發的耐藥性測試、腫瘤負荷即時監控及呼吸道疾病的檢測等。

在2018年，中國研究人員使用DD PCR檢測4種與胃癌相關的micro RNA（miR-21，miR-93，miR-106a和miR-106b）。在147名參與者的訓練隊列（training cohort）和28名參與者的驗證隊列（validation cohort）中，抽取患者血漿以鑑定這4種micro RNA與胃癌的發生的相關性。與健康對照組相比，他們發現患者血漿的micro RNA水平（level）均顯著較高（P <0.05），而且已知miR21，miR-93和miR-106b水平與胃癌患者的晚期腫瘤轉移分期（TNM stage，T（tumor）：原發腫瘤的大小和局部侵犯的程度；N（lymph node）：腫瘤局部區域和淋巴腺蔓延的程度；M（metastasis）：有否遠端轉移）有顯著相關性。試驗結果顯示，若採用DD PCR對患者進行診斷，miR-21，miR-93，miR-106a和miR-106b可作為診斷胃癌的血漿生物標誌物（plasma biomarker）。此外，DD PCR可以協助醫療人員更加精確地追蹤病患在治療期間不同時段的血清micro RNA濃度變化情況。

在2020年，新加坡研究人員使用DD PCR和即時定量PCR的方法用於檢測真菌提取物的DNA，評估DD PCR量化呼吸道麴菌（Aspergillus）的功能是否較佳。從健康人（人數n = 4）、慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease）患者（n = 8）和非囊性纖維化支氣管擴張（non-cystic fibrosis bronchiectasis）患者（n = 8）獲得的20個痰液檢體中，他們發現即使麴菌數量很低，2種PCR都能從已知含有麴菌的檢體中檢測出麴菌－Aspergillus fumigatus及Aspergillus terreuss，其中後者是慢性呼吸道疾病（如支氣管擴張）的致病菌。然而，與即時定量PCR相比，DD PCR在檢測Aspergillus terreuss時表現出更優異的性能，特別在真菌含量非常低的情況下。試驗結果顯示，DD PCR對存於檢體的Aspergillus terreuss具有較高的敏感性，而且對阻止核酸含量藉由PCR來擴增的抑制作用（PCR inhibition）表現出更大抗性。

參考資料：

1. Hindson CM, Chevillet JR, Briggs HA, Gallichotte EN, Ruf IK, Hindson BJ, Vessella RL, Tewari Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nat Methods. 2013 Oct;10(10):1003-1005. doi: 10.1038/nmeth.2633.
2. ZhaoG, Jiang T, Liu Y, Huai G, Lan C, Li G, Jia G, Wang K, Yang Droplet Digital PCR-based Circulating microRNA Detection Serve as a Promising Diagnostic Method for Gastric Cancer. BMC Cancer. 2018 Jun 22;18(1):676. doi: 10.1186/s12885-018-4601-5.
3. Poh TY, Nur Ali ABM, Chan LLY, Tiew PY, Chotirmall Evaluation of droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) for the Absolute Quantification of Aspergillus Species in the Human Airway. Int J Mol Sci. 2020 Apr 26;21(9):3043.doi: 10.3390/ijms21093043.