微滴式數字聚合酶連鎖反應(DD PCR)的技術及應用

微滴式數字聚合酶連鎖反應(Droplet digital polymerase chain reaction, DD PCR)是一種數位化基因偵測系統,分別對標的分子進行PCR擴增後,再以螢光訊號進行統計分析,可偵測樣品的絕對DNA分子個數,對核酸分子進行絕對定量(absolute quantification),而不再只是相對定量(relative quantification)。DD PCR已克服了傳統PCR系統成本高、通量有限、流程複雜、精確度低等缺點,適用範圍十分廣泛,包括食品的檢測、環境的監測及疾病的診斷等。

撰文/陳淵銓

●微滴式數字聚合酶連鎖反應DD PCR的認識

DD PCR對樣品進行微滴化處理,使得待測核酸片段均勻的稀釋,意即將含有核酸分子的反應體系分成很多個微滴,再分散至大量的微反應器或微油滴中,每個微滴或含有1個待檢標的(target)核酸或不含待檢核酸。

標的核酸經PCR擴增後,再對每個微滴進行檢測,有螢光信號的微滴含有DNA模板判讀為1,沒有螢光信號的微滴不含DNA模板則判讀為0,根據卜瓦松分布(Poisson distribution)原理及陽性微滴的個數、比例,即可得出標的核酸的起始拷貝數(copy number)或濃度,再以軟體計算出標的核酸的絕對定量。

與傳統PCR(第一代)及即時定量PCR(第二代)相比,DD PCR(第三代)數據具有更高的準確度、精密度及靈敏度,而且無需內控制組(internal control)。因DD PCR靈敏度很高,故僅需要很少的模板量,可精確檢測微量及不易得到的樣品中的核酸,彌補了前兩代PCR難以精確測定基因拷貝數量、無法對微量突變定性或定量及精密度低等缺點,技術優勢如下:

  1. 單分子分析:將微量樣本再細分成數萬個微滴,實現臨床樣本的單分子分析。
  2. 真正的絕對定量:無需標準曲線,檢測下限可低至單拷貝數,可統計突變率;不依賴擴增效率,能克服PCR抑制劑的影響。
  3. 不依賴Cq(quantification cycle)值:可確定偵測低至單拷貝待檢標的分子的絕對數目。Cq值:PCR擴增過程中,擴增產物(螢光信號)到達閾值(threshold value)所需的擴增循環次數。
  4. 數據分析自動化:每個微滴的檢測結果以陰性或陽性標示,由儀器直接判讀,樣本被稀釋成許多部分,再於反應發生時計數,靈敏度可達001%,顯著高於擴增阻滯突變系統(0.1%)和Sanger測序法(10%)。
  5. 使用靈活:可依實驗需要調整通量和靈敏度。

●七項DD PCR 的應用範圍

一、次世代定序(new generation sequencing, NGS):無需使用標準曲線,直接對NGS檢體庫執行絕對定量分析。

二、基因表達分析(gene expression analysis):對微量mRNA和miRNA的細微變化進行可靠的和可重複的檢測。

三、基因複製數量變異性檢測(copy number variation detection):可準確測量核酸片段複製數量的變化。

四、超微量檢測(rare event detection):可針對基因單點突變、核酸片段複製數目變化或核酸序列鹼基對的嵌入(insertion)或刪除(deletion)作超微量檢測,可以準確檢測到001%的突變(即時定量PCR靈敏度約為1%)。

五、基因表現分析(gene expression analysis):基因表達差異區分倍數可達25X以下(即時定量PCR之有效區分的倍數為2X),尤其對低表現量的基因,都能達到更準確的定量。

六、病原體檢測(pathogen detection):與相對定量的即時定量PCR比較,絕對定量的DD PCR能提供更高準確度與靈敏度的病原體載量(load)檢測結果。

七、次世代定序檢體庫的定量 (NGS library quantification):檢測NGS檢體庫的核酸片段大小是否正確並予以定量,確認檢體是否適合上機,高靈敏度可提高上機的成功率。

●DD PCR 的臨床應用

DD PCR 現已臨床應用在疾病的診斷和監測,如癌症的早期篩檢、腫瘤繼發的耐藥性測試、腫瘤負荷即時監控及呼吸道疾病的檢測等。

在2018年,中國研究人員使用DD PCR檢測4種與胃癌相關的micro RNA(miR-21,miR-93,miR-106a和miR-106b)。在147名參與者的訓練隊列(training cohort)和28名參與者的驗證隊列(validation cohort)中,抽取患者血漿以鑑定這4種micro RNA與胃癌的發生的相關性。與健康對照組相比,他們發現患者血漿的micro RNA水平(level)均顯著較高(P <0.05),而且已知miR21,miR-93和miR-106b水平與胃癌患者的晚期腫瘤轉移分期(TNM stage,T(tumor):原發腫瘤的大小和局部侵犯的程度;N(lymph node):腫瘤局部區域和淋巴腺蔓延的程度;M(metastasis):有否遠端轉移)有顯著相關性。試驗結果顯示,若採用DD PCR對患者進行診斷,miR-21,miR-93,miR-106a和miR-106b可作為診斷胃癌的血漿生物標誌物(plasma biomarker)。此外,DD PCR可以協助醫療人員更加精確地追蹤病患在治療期間不同時段的血清micro RNA濃度變化情況。

在2020年,新加坡研究人員使用DD PCR和即時定量PCR的方法用於檢測真菌提取物的DNA,評估DD PCR量化呼吸道麴菌(Aspergillus)的功能是否較佳。從健康人(人數n = 4)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease)患者(n = 8)和非囊性纖維化支氣管擴張(non-cystic fibrosis bronchiectasis)患者(n = 8)獲得的20個痰液檢體中,他們發現即使麴菌數量很低,2種PCR都能從已知含有麴菌的檢體中檢測出麴菌-Aspergillus fumigatusAspergillus terreuss,其中後者是慢性呼吸道疾病(如支氣管擴張)的致病菌。然而,與即時定量PCR相比,DD PCR在檢測Aspergillus terreuss時表現出更優異的性能,特別在真菌含量非常低的情況下。試驗結果顯示,DD PCR對存於檢體的Aspergillus terreuss具有較高的敏感性,而且對阻止核酸含量藉由PCR來擴增的抑制作用(PCR inhibition)表現出更大抗性。

 

參考資料:

  1. Hindson CM, Chevillet JR, Briggs HA, Gallichotte EN, Ruf IK, Hindson BJ, Vessella RL, Tewari Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nat Methods. 2013 Oct;10(10):1003-1005. doi: 10.1038/nmeth.2633.
  2. ZhaoG, Jiang T, Liu YHuai GLan C, Li GJia G, Wang K, Yang Droplet Digital PCR-based Circulating microRNA Detection Serve as a Promising Diagnostic Method for Gastric Cancer. BMC Cancer. 2018 Jun 22;18(1):676. doi: 10.1186/s12885-018-4601-5.
  3. Poh TY, Nur Ali ABM, Chan LLY, Tiew PY, Chotirmall Evaluation of droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) for the Absolute Quantification of Aspergillus Species in the Human Airway. Int J Mol Sci. 2020 Apr 26;21(9):3043.doi: 10.3390/ijms21093043.
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