逆轉錄子(Retron)的功能及應用潛力

Retron是DNA、RNA及蛋白質的複合物,可進行靶向逆轉錄而產生多拷貝單鏈DNA (msDNA) ,是一種目前尚未被了解得很清楚的細菌逆轉錄元件。然而,近年的研究已經發現,Retron可以用於對抗噬菌體及在基因組中創建特定編輯時作為重組工程的供給者,顯示Retron 有發展成為對抗噬菌體的平台及基因編輯工具的潛力,惟Retron實際應用的效率及成功率仍有待進一步研究、測試及改善。

 撰文|陳淵銓

●什麼是逆轉錄子

以往逆轉錄酶(reverse transcriptase, RT)被認為僅存在於病毒,原核生物並未含有逆轉錄酶,但科學家現已陸續發現在多種細菌中存有RT編碼元(RT-encoding element)件(逆轉錄元件)。在1984年,研究人員首先在細菌DNA中的短衛星RNA/DNA分子逆轉錄物中發現了逆轉錄子(retron),現更發現Retron是存在於許多種細菌基因組中的一種獨特DNA序列,可以編碼逆轉錄酶以及獨特的單鏈DNA-多拷貝單鏈 DNA(multicopy single-stranded DNA, msDNA)。Retron操縱元(operon)攜帶一個啟動子序列(promoter sequence),該序列控制帶有三個基因座的RN​​A轉錄物(transcript)的合成:msr、msd 和 ret。ret基因的產物是逆轉錄酶,可將RNA轉錄物的msd/msr 部分逆轉錄合成 msDNA。Retron msr RNA是由逆轉錄元件產生的非編碼 RNA(noncoding RNA)(逆轉錄合成 msDNA 的直接轉錄物),可折疊成一個特殊的二級結構,利用逆轉錄酶合成的DNA會產生RNA/DNA嵌合體(hybrid),該嵌合體由小單鏈RNA與小單鏈DNA結合形成。

●Retron可以對抗噬菌體

在2020年,以色列及奧地利研究人員探索了多個逆轉錄系統,證明 Retron可以引發流產感染(abortive infection)而提供大腸桿菌對大多數噬菌體的廣泛防禦力。他們針對retron Ec48進行研究,發現會抑制RecBCD(一種細菌內抗噬菌體的主要複合物)的噬菌體感染細菌後,會啟動細菌的逆轉錄防禦系統以激發Retron的合成,而使得Retron及其作用蛋白(effector protein)對RecBCD進行保護。

●Retron可作為基因編輯工具

利用Retron的基因編輯技術稱為寡核苷酸重組工程(oligonucleotide recombineering),這個方法是將同時含有標的DNA序列的Retron與逆轉錄酶基因的質體引進到細菌細胞內,雙鏈DNA(double-stranded DNA, dsDNA)轉錄生成 RNA,RNA在RT 的作用下合成互補DNA(complementary DNA, cDNA)而形成 RNA/DNA 嵌合體(hybrid)。Retron產生單鏈DNA(single-stranded DNA, ssDNA),在單鏈黏合蛋白(single-stranded annealing protein, SSAP)的作用下,該段含有標的DNA序列的多拷貝單鏈DNA(msDNA)會被嵌入到正在進行複製的DNA中。

在2020年,韓國研究人員開發了一個CRISPR/Retron系統,利用可連續表達供給者DNA的逆轉錄Retron和可誘導標的基因組位點切割的CRISPR/Cas9結合系統(Retron/ CRISPR  combination system),造成細菌多個替代突變(substitution mutation)。他們以高通量方式(大量基因實驗)有效地在大腸桿菌基因組中引入替代突變,再藉由分析逆轉錄體序列來追踪這些突變,顯示CRISPR/Retron結合系統可以在一個實驗中引進數千個突變,並用於篩選與化學反應或適應性變化相關的表現型。

在2021年,美國研究人員在人類細胞培養的研究中,測試Retron產生多拷貝單鏈DNA(msDNA)作為供給者(donor)DNA以增加同源定向修補(homology directed repair, HDR)的能力,在細胞中引導RNA來促進HDR,結果發現HDR比率高達11.3%。此外,本研究顯示利用Retron來產生細胞內gRNA/ msDNA 嵌合體,可用於CRISPR/Cas9介導的人類細胞中HDR。

在2021年,美國研究人員使用基於逆轉錄作用原理的基因組編輯工具-Retron Library Recombineering(RLR)來研究Retron在細菌中的表現。他們利用Retron的靶向逆轉錄活性(targeted reverse-transcription activity)在細菌體內產生多拷貝單鏈DNA(msDNA),以高於90% 的效率整合編輯並進行多重應用,使用RLR對合成的抗生素抗性等位基因進行匯總表現型分析(pooled phenotyping),還使用細菌剪切的基因組DNA進行RLR,用於探索數百萬個序列的因果變異體(causal variant),證明RLR可以提供探索大量基因組變異的途徑。此外,作者認為與CRISPR/Cas9相較,RLR具有下列優勢,而有開發作為基因編輯工具的潛力:

1.可同時篩選大量DNA序列:RLR可在原位(in situ)隨機切碎細菌基因組,將這些遺傳片段原位轉化為多拷貝單鏈DNA(msDNA),用於同時篩選數百萬個DNA序列。

2.便於追蹤:Retron可作為”條碼(barcode)”或”名稱標籤(name tags)”,使科學家能夠追踪細菌池(bacterial pool)中個別細胞的變異情形,並可用在一個大混合物中進行多個實驗。

3.操作更簡單且安全:RLR不使用酵素切割DNA,故不會啟動修補(repair)及整合(integration)機制,可排除脫靶效應 (off target)及引發突變的可能性。

Retron是可參與對抗噬菌體之防禦機制的細菌遺傳逆轉錄元件,並已成功用於細菌細胞的基因標靶作用(gene targeting),或者在酵母菌、人類細胞培養中與 CRISPR/Cas9結合以提高基因編輯的效率,應用範圍廣泛且看似頗有前景。然而,不論用於對抗噬菌體或用作為基因編輯工具,Retron目前僅止於細菌、酵母菌或人類細胞培養(cell culture)的實驗中成功,迄無任何成功用於動物實驗或植物體研究的文獻或報告,若要實際應用仍待進一步研究及測試。

 

參考資料

  1. Millman A, Bernheim A, Stokar-Avihail A, Fedorenko T, Voichek M, Leavitt A, Oppenheimer-Shaanan Y, Sorek R. Bacterial retrons function in anti-phage defense. 2020 Dec 10;183(6):1551-1561.e12. doi: 10.1016/j.cell.2020.09.065. Epub 2020 Nov 5.
  2. Lim H, Jun S, Park M, Lim J, Jeong J, Lee JH, Bang D. Multiplex generation, tracking, and functional screening of substitution mutants using a CRISPR/Retron system. ACS Synth Biol. 2020 May 15;9(5):1003-1009. doi: 10.1021/acssynbio.0c00002. Epub 2020 May 4.
  3. Zhao B,  Chen SA, Lee J,  Fraser HB. Bacterial retrons enable precise gene editing in human cells. bioRxiv - Bioengineering, 2021-03-29, doi: https://doi.org/10.1101/2021.03.29.437260.
  4. Schubert MG, Goodman DB, Wannier TM, Kaur D, Farzadfard F, Lu TK, Shipman SL, Church GM. High-throughput functional variant screens via in vivo production of single-stranded DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 May ;118(18):e2018181118. doi: 10.1073/pnas.2018181118.
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