開發CRISPR 居家檢測平台對抗COVID-19

由COVID-19引起的全球大流行已顯示缺乏有效的治療藥物及預防疫苗,對疫情及疾病的管制十分不利且困難,所以準確並快速的診斷工具對於傳染病的早期識別和治療至關重要,有助及時實施感染控制,並改善臨床護理和公共衛生措施以阻止疾病傳播。CRISPR已被成功開發作為基因編輯(gene editing)的工具,廣泛應用於生物體的基因改造,當前並開發用於新興傳染病的快速核酸檢測,深具潛力作為COVID-19居家檢測的平台。

撰文/陳淵銓

●CRISPR的認識

叢集有規律間隔的短迴文重複序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats , CRISPR)原本是一種原核生物(細菌)為了對抗外來遺傳物質,如質體(plasmid)或噬菌體(bacteriophage)的DNA,而在宿主體內產生的後天免疫(adaptive immunity)系統,細菌會對曾侵入的DNA產生記憶(memory),當序列相同的DNA再次進入細菌時,便會產生後天性免疫反應以分解此外來的DNA。CRISPR包含多重的、短的及直接的DNA序列重複體,每個重複體含有一系列伴隨著約30個稱為間隔 DNA(spacer DNA)的鹼基對,這些間隔是來自質體或噬菌體的短DNA片段(fragment),當宿主再度遭遇這個特定的質體或噬菌體時,便會藉由與 CRISPR RNA(crRNA)的互補作用而辨認外來的DNA,crRNA和互補性外來的 DNA的結合後,藉由Cas9蛋白(核酸酶)來分解破壞入侵的DNA或RNA。作用機轉如下:單股導引RNA(single-guiding RNA, sg RNA)會與 Cas9白進行交互作用,二者結合後會引導內核酸酶活性到 與 protospacer 序列鄰近的區域(protospacer adjacent motif, PAM),sgRNA 辨認特定的DNA序列後,結合的Cas 9會裁切在DNA正反兩股的 PAM(NGG)上游各3個核苷酸的位置,形成鈍端(blunt end)的雙股斷裂(double-stranded break)。

使用傳統的聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction, PCR)診斷是否感染新冠病毒,不僅耗時費事,還需有精密儀器及專業醫療人員的配合,所以開發出一種不須依賴專業設備和人員的新式的智能性快速診斷方法是有需要的,最近CRISPR亦被引入核酸快速檢測領域,用於開發新型的新冠肺炎(Coronavirus disease 2019, COVID-19)的檢測工具及試劑。

●開發CRISPR作為COVID-19的檢測平台

在今年(2020年),中國研究人員在一篇評論文章中總結了關於各種CRISPR用於COVID-19檢測的最新進展,包括CRISPR/Cas9,CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13,正在被開發作為快速,準確和便攜式的診斷方法,顯示CRISPR可被應用於COVID-19和其他新興傳染病診斷的潛力。與聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction assay, PCR)和DNA測序法相比,這個新方法可以較快速鑑定出新興傳染病的病原體,並有助於及時的治療。雖然理想的檢測試劑特色在於快速、可靠、廉價且方便,但是這些新興的診斷方法仍需要仔細的測試和臨床驗證,以確保其功能。

美國科學家Ackerman提出一個名為CARMEN(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking, SHERLOCK的延伸)平台,可以檢測一系列的病原體感染,包括引起COVID-19的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染。檢測混合物包含sgRNA、Cas13及有螢光標記的報導RNA(reporter RNA),螢光分子由於附著在報導RNA上而不會發出光。sgRNA能夠識別特定的標的核酸(DNA或RNA)序列,如果CRISPR/Cas13複合體識別出標的核酸序列,則Cas13會被激活而切割報導RNA並產生螢光,從而檢測樣本有特定病毒感染。

而美國Mammoth Biosciences與GSK公司亦宣布開發一種以CRISPR為基礎的SARS-CoV-2檢測平台DETECTR(DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter),可快速(小於40分鐘)且準確的從受測者鼻拭子RNA提取物中檢測SARS-CoV-2。他們使用來自美國患者的人工參考樣品和臨床樣品來驗證這個方法,包括36例COVID-19患者和42例其他病毒呼吸道感染患者,發現檢測結果陽性預測一致性為95%,陰性預測一致性為100%,證明這是一種可以看的見且快速的檢測方法,並具有潛力替代目前最廣泛使用的定量即時逆轉錄聚合酶連鎖反應分析法(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay, qRT-PCR)。這個檢測平台的特色是快速、容易操作、可攜式(手持式)及完全一次性,能透過簡單的鼻拭子辨識SARS-CoV-2 的RNA,並不需要複雜的實驗室環境、大型儀器設備和耗時的實驗過程,在約20分鐘即能得到檢測結果,而且可檢測多種傳染病,相關研究結果已發表在 Nature Biotechnology 期刊。美國FDA正在對該平台進行緊急使用授權(emergency use authorization, EUA)審查,GSK預計在2020年底前,將整個檢測平台提交給FDA進行評估,並將之推廣成為醫院和診所的即時檢測工具,再進一步提供非處方檢測讓一般民眾在家中使用。

Mammoth Biosciences執行長兼創始人Trevor Martin說:「COVID-19是目前大家檢測的重點,但是為了盡社會責任,需要的是診斷的根本轉變,亦即是一種可擴展的手段,可以廣泛地解決疾病檢測問題。因此,藉由以CRISPR為基礎的診斷技術,我們能在不影響所有類型傳染病檢測準確性的條件下,實現快速的檢測。」此外,GSK消費者醫療保健部門總監 Brian McNamara亦表示:「我們期待在COVID-19流行期間,幫助民眾保持健康,並認為取得迅速、準確及高品質的檢測結果是十分重要的。與Mammoth Biosciences合作,可以貢獻專業知識完成開發一種一次性的快速檢測平台,讓一般民眾也能在居家檢測COVID-19,希望將檢測的力量帶出實驗室,並進入人們的家中。」

 

參考資料:

  1. Storch CRISPR Tool Scales Up to Interrogate a Huge Line-Up of Viral Suspects. Nature. 2020 May 18. doi: 10.1038/d41586-020-01447-w. Online ahead of print.
  2. Broughton JP, Deng X, Yu G,  Fasching CL, Servellita V,  Singh J, Miao X, Streithorst JA, Granados A, Sotomayor-Gonzalez A, Zorn K, Gopez A, Hsu E, Gu W,  Miller S,  Pan CY,  Guevara H,  Wadford DA, Chen JS, Chiu CRISPR-Cas12-based Detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 2020 Apr 16. doi: 10.1038/s41587-020-0513-4. Online ahead of print.
  3. Xiang X, Qian K, Zhang Z,  Lin F, Xie Y, Liu  Y, Yang CRISPR-Cas systems based molecular diagnostic tool for infectious diseases and emerging 2019 novel coronavirus (COVID-19) pneumonia. J Drug Target. 2020 May 26;1-5. doi: 10.1080/1061186X.2020.1769637. Online ahead of print.
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