單株抗體—HAT培養基（HAT medium）

單株抗體—HAT培養基（HAT medium）
國立臺灣大學醫學系林祐民、臺北市立建國高中劉翠華教師

關於單株抗體（monoclonal antibody）的背景與原理請參閱國科會高瞻計畫自然科學教學資源平台—單株抗體（上）及單株抗體（下），本篇著重於介紹在單株抗體的細胞融合實驗中常被使用的 HAT 培養基（HAT medium）。

細胞融合是單株抗體製作過程中的一項重要技術，將 B 細胞與骨髓瘤細胞（myeloma cell）融合，融合後產生的細胞稱為融合瘤（hybridoma），融合瘤同時具有 B 細胞分泌抗體，以及癌細胞不斷分裂而不受分裂次數限制的特性。HAT 培養基即是用以培養及篩選融合瘤細胞的培養基。

細胞融合時，實驗者無法控制所有細胞融合的過程及對象。若將 B 細胞簡寫為 B，骨髓瘤細胞簡寫為 M，則融合時可能產生無數種組合，其中包含未融合的單一細胞、兩個細胞融合或是多個細胞融合（例如：B、M、B+B、B+M、M+M、B+B+B、B+M+B、M+M+M、B+B+B+B等等），其中我們只想挑出同時具有 B 以及 M 細胞的組合，而 HAT 培養基則扮演此重要角色。

「HAT 培養基」名字的由來，是因為其中含有的三個關鍵化合物：次黃嘌呤 hypoxanthine、氨喋呤 aminopterin、胸苷 thymidine。

其中氨喋呤（aminopterin）會抑制二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase）的活性，導致二氫葉酸（dihydrofolate）無法被還原為四氫葉酸（tetrahydrofolate）而阻礙了細胞中 DNA 生合成一個重要的步驟：將 dUMP 轉化為 dTMP。

一般細胞在此狀況下能夠有替代的選擇：將胸苷（thymidine）利用胸苷激脢（thymidine kinase，TK）轉化成胸苷單磷酸（thymidine monophosphate，TMP），並將次黃嘌呤（hypoxanthine）利用次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶（hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase，HGPRT）反應產生肌核苷單磷酸（inosine monophosphate，IMP），IMP 可再進一步合成腺苷單磷酸（AMP）及鳥苷單磷酸（GMP）。

前一段所述為正常細胞所能採用替代的代謝路徑，故單株抗體細胞融合實驗中的 B 細胞能夠在 HAT 培養基內存活，但因為 B 細胞本身壽命的限制，無法無限次的分裂，故未融合的 B 細胞（或只含有 B+B…而沒有 M 的融合株）無法在 HAT 培養基內形成群落。

而單株抗體的細胞融合常用的 NS-1 癌細胞株有另一個特色，其細胞缺乏兩種核酸代謝的重要酵素，恰為 TK（thymidine kinase）及 HGPRT（hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase），故在 HAT 培養基中，NS-1 癌細胞不僅無法由 dUMP 開始核酸的生合成，也無法自替代路徑有效利用胸苷（thymidine）及次黃嘌呤（hypoxanthine）合成，故未融合的癌細胞（或只含有 M+M…而不含 B 的融合株）也無法在 HAT 培養基內存活。

綜合前兩段所述，依據 HAT 培養基的特性，僅有同時具有 B 及 M 的融合瘤能夠在 HAT 培養基內形成細胞群落。實驗者能夠有效地從所有細胞融合後的細胞中挑選出同時融合有 B 細胞及 NS-1 細胞融合瘤，這樣的融合瘤才既能夠分泌抗體且無分裂次數限制的特性，作為製備單株抗體的理想細胞株。

參考資料及圖片來源：單株抗體 http://juang.bst.ntu.edu.tw/ECX/monoclonal.htm#3C