原位雜合技術 （In situ hybridization；ISH）

原位雜合技術 （In situ hybridization；ISH）
臺灣大學生命科學所 霍其嶸

原位雜合（下簡稱為：ISH）是一種被廣泛使用來確認組織及細胞中特定DNA或是RNA表現位置的方法。最早是由美國生物學家Mary-Lou Pardue跟Joseph G. Gall在1969年所發明的。當生物體的個體不是很大時，可以在不進行切片或是分離的狀況下進行染色，這種做法稱之為全標本包埋原位雜合（Whole – mount in situ hybridization, WISH）。

ISH的原理其實和南方墨點法（Southern blotting）類似，都是利用核酸序列會互補的特性來設計探針（probe）去標定互補（Complementary）DNA或RNA。RNA探針必須要能夠和生物體的RNA進行互補結合，所以使用的序列為反股RNA（antisense RNA），正股的探針因為和組織或是細胞內所含有的RNA相同，所以無法進行互補，故常被用來做為陰性對照組（Negative control）。

DNA或是RNA探針和序列互補結合之後，會利用抗體去辨識及呈色。為了要讓抗體可以辨識部分核酸，雜合探針在製作的過程中，並不會使用一般聚合酶連鎖（PCR）反應中使用的核糖核苷三磷酸（ribonucleoside triphosphate；rNTP），而是會使用具有放射性、螢光或是抗原標定過核醣核苷三磷酸。如：Digoxigenin標定的核醣核苷三磷酸（DIG-rNTP）為目前最常被使用的類型。

圖一、ISH的原理（圖片來源：霍其嶸）

由於抗體本身無法呈色，所以一般呈色方法通常透過鹼性磷酸酶（Alkaline phosphate）結合抗體進行染色。因為鹼性磷酸酶的受質5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate（BCIP）會被環境中的氧氣或是Nitro blue tetrazolium chloride （NBT）氧化，產生藍色的沉澱物，所以可用來標示出探針和特定基因在組織或是細胞中結合的位置，也就是特定基因在組織或是個體表現的準確位置。這種方法被稱為顯色原位雜合技術（Chromogenic in situ hybridization, CISH）。若是在抗體上直接接上螢光素來標定，不需要酵素跟沉澱物的反應，則稱之為螢光原位雜合技術（Fluorescence in situ hybridization, FISH）。

CISH的實驗會依照使用的探針種類、呈色方法而有些許變化，但實驗步驟大致如下：

1. 首先要使用像是Protease K 的蛋白酶，去破壞細胞膜（cell membrane）讓水溶性的探針可以進入胞內。
2. 當探針通過細胞膜進入胞內之後，需要讓探針和特定的DNA或是RNA進行雜合。這個步驟通常會在高溫60-65℃ 的狀況下進行。為了確保探針和DNA或RNA能順利的進行結合，通常此步驟會持續進行12個小時以上。
3. 雜合結束之後，再使用抗體去標定特定的探針。
4. 最後在使用NBT/BCIP等鹼性磷酸酶受質來呈色。

圖二、在瓢體蟲（Aeolosoma viride）上進行的WISH。 左圖為正股（Sense）探針的控制組，右圖為反股（Antisense）的實驗組。（圖片來源：霍其嶸）

參考文獻

1. “Best 25 In situ hybridization ideas on Pinterest | Electron microscope, Electron capture and Microscopic photography.” Pinterest, www.pinterest.com/explore/in-situ-hybridization/
2. “Home.” , CISH, and FISH Reagents | Thermo Fisher Scientific, www.thermofisher.com/tw/zt/home/life-science/cell-analysis/cellular-imaging/in-situ-hybridization-ish.html.
3. “Fluorescence in situ hybridization.” Nature News. March 01, 2005. Accessed October 24, 2017. http://www.nature.com/nmeth/journal/v2/n3/abs/nmeth0305-237.html.
4. “In Situ Hybridization (ISH).” National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techish/.
5. “In Situ Hybridization.”Wikipedia, Wikimedia Foundation, 19 Feb. 2018, en.wikipedia.org/wiki/In_situ_hybridization#/media/File:Hunchback_in_situ.jpg.
6. “In situ hybridization.” Wikipedia, Wikimedia Foundation, 16 Aug. 2017, en.wikipedia.org/wiki/In_situ_hybridization.
7. 特色圖片：以原位雜合方式標定不同發生階段中果蠅胚胎的hunchback 核醣核酸
   （圖片來源：維基百科）