使用 CRISPR 技術清除體內的愛滋病病毒

使用 CRISPR 技術清除體內的愛滋病病毒
德州大學分子生物科學研究所馬千惠/國立臺灣大學生命科學系陳俊宏教授責任編輯

過去四年來CRISPR/Cas9基因編輯技術，被廣泛使用於基礎科學以及臨床前實驗。Cas9 酵素在引導RNA (guide RNA) 序列帶領下，可以切斷特定的基因位置，造成双股 DNA的斷裂，細胞偵測到受損的DNA會起動修補機制，可以大幅提高基因同源重組的效率，使得編輯各種細胞和器官的基因變得容易且快速。在醫學研究上，科學家們致力於應用此技術來發展具有潛能的治療方式，包括治療遺傳疾病、癌症以及感染性疾病等(1,2)。

愛滋病的病原體是人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV-1），目前仍持續危害大眾的健康，全球有超過四千萬的人感染愛滋病，而且每年以多於兩百萬人感染的速度增加中。目前廣泛使用俗稱「雞尾酒療法」的聯合反轉錄病毒療法(Combination antiretroviral therapy, cART) 來抑制活躍的病毒複製，減緩病情的發展，降低發病率和死亡率，但是仍然沒有辦法痊癒，而且一旦停止用藥，病毒會自行開始複製，造成病情惡化。其主要原因是 HIV-1病毒具有躲避並且長期潛伏在體內的特性，HIV-1病毒會從其單股RNA反轉錄出雙股DNA，並且嵌入病人基因體內，使免疫系統無法察覺，非常難從病人體內完全清除乾淨。美國天普大學路易斯卡茲醫學院 (Lewis Katz School of Medicine at Temple University) 和匹茲堡大學研究團隊的最新研究成果，有了突破性的發展。研究顯示利用 CRISPR/Cas9 技術，可以有效地將潛伏在動物DNA中的 HIV-1 病毒基因移除，去除後續感染的狀況。此研究團隊最先以三種實驗動物，來進行此壯舉實驗的團隊。研究成果於2017年五月初刊登於Molecular Therapy期刊 (1)。

延續該研究團隊於 2016年發表的論文，當時成功地將大部分嵌在基因轉殖大鼠及老鼠器官組織的 HIV-1病毒基因片段移除掉。新的研究結果則更加明確，而且經過改良的CRISPR/Cas9系統效率更高，更成功地使用於三種活體實驗動物中。研究人員使用腺相關病毒(AAV) 載體輸送系統，選擇AAV-DJ 和AAV-DJ/8兩種載體，可以傳送至更多種組織和器官，同時承載四種不同的引導 RNA轉錄單位，以及來自菌種 Saphylococcus aureus 比較小的Cas9 (簡稱為 saCas9)基因，將此基因編輯載體以靜脈注射的方法打入老鼠體內，再送到不同的標的細胞。研究人員成功地將基因轉殖老鼠 (HIV-1 Tg26 trangenic mouse) 基因體內的 HIV-1 DNA 切斷移除，減少病毒基因大約 60到 95%的 RNA表現量，進一步證實他們先前的研究結果。另外將此系統送入兩種不同的實驗老鼠也同樣可行，其中一種實驗老鼠是感染 EcoHIV 病毒(相當於人類的 HIV-1病毒），正處於急性感染的狀況，他們成功地以此技術阻斷病毒複製，進而預防系統感染。清除病毒的效率在肝細胞可達到 96%，證明可以用CRISPR/Cas9系統進行預防性治療並且根除病毒。第三種實驗動物是移植有人類細胞於各個組織器官的人類化老鼠(BLT mice)，同時感染HIV-1病毒，處於長期潛伏感染狀況。令人驚嘆的是，僅僅一次治療，即成功地將潛伏在不同組織器官內的病毒基因片斷移除。

圖：移除大部分嵌在基因轉殖大鼠及老鼠器官組織的 HIV-1病毒基因片段實驗

（圖片來源：Molecular Therapy 2017, 25(5), 1063.）

為了判斷這策略是否成功，研究團隊測量HIV-1病毒的 RNA表現量，同時使用由Won-Bin Young 博士新開發的活體生物發光影像系統，準確地顯示受HIV-1 感染的細胞在動物體內分佈的位置和存在的時間，讓研究人員可以同步觀察病毒複製以及其潛伏在受感染細胞和組織的情況。比較治療組和對照組，可以看到經由 CRISPR/Cas9 治療的老鼠其病毒指標明顯減少，表示策略成功!

總結來說，新的治療方式以腺相關病毒（AAV) 為運送系統，將改良過包含有四種引導 RNA及 saCas9的基因編輯載體，成功地運送至各個组織器官，進而有效地移除嵌在寄主細胞基因體內的 HIV-1病毒基因。避免病毒以突變方式躲掉偵測，達到完全的治療效果。

研究團隊對他們的研究發現感到興奮，也對下一步的研究表示樂觀。下一個階段將是在靈長類動物重複整個實驗過程，可以更加了解去除病毒的狀況，並且了解病癥的演變。最終目標是在臨床上運用到病人身上，給予愛滋病患完全痊癒的治療 。

參考文獻:

1.         Yin, C., Zhang, T., Qu, X., Zhang, Y., Putatunda, R., Xiao, X., Li, F., Xiao, W., Zhao, H., Dai, S. et al. (2017) In Vivo Excision of HIV-1 Provirus by saCas9 and Multiplex Single-Guide RNAs in Animal Models. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy, 25, 1168-1186.
2.         Kaminski, R., Bella, R., Yin, C., Otte, J., Ferrante, P., Gendelman, H.E., Li, H., Booze, R., Gordon, J., Hu, W. et al. (2016) Excision of HIV-1 DNA by gene editing: a proof-of-concept in vivo study. Gene therapy, 23, 696.